Cancer Research

导管内递送和X射线可视化乙醇烧蚀溶液在小鼠模型中预防和局部治疗乳腺癌

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63457

Elizabeth Kenyon^1,2, Erin K. Zaluzec^1,3, Katherine Powell^1,2, Maximilian Volk^1,4, Shatadru Chakravarty^2,5, Jeremy Hix^2,6, Ripla Arora^7,8, Jennifer J. Westerhuis^9,10, Matti Kiupel¹¹, Erik M. Shapiro^2,6, Lorenzo F. Sempere^1,2

Summary

描述了一种将用于乙醇基烧蚀溶液的试剂引入管内注射到小鼠乳腺导管树中的方法，用于体内成像和乳腺癌预防。直接注射到开口中可以靶向乳腺上皮细胞，同时将侧支组织损伤降至最低。

Abstract

乳腺癌是美国女性癌症最普遍的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。对于高危女性，预防性乳房切除术是最有效的一级预防策略。预防性乳房切除术是一种积极的外科手术，可完全去除乳腺癌与周围组织一起产生的乳腺上皮细胞。我们寻求开发一种微创导管内手术，作为预防性乳房切除术的替代方案，以便在乳腺上皮细胞变成恶性细胞之前局部消融它们。我们和其他人已经开发了一种导管内递送程序，以达到和治疗乳腺癌啮齿动物模型中的这些上皮细胞。虽然在处具有单个非吻合导管树开口的小鼠乳腺具有比人类乳房更不复杂和曲折的结构，但化学诱导和基因工程的乳腺癌小鼠模型对于产生新的预防策略的概念验证研究是有价值的。在这里，我们描述了在小鼠乳腺导管树内输注含有micro-CT / X射线钽基造影剂的乙醇基烧融溶液的导管内递送程序，用于乳腺癌一级预防的治疗目的。水性试剂（例如细胞毒性化合物、siRNA、AdCre）的导管内递送先前已在小鼠模型中描述过。因此，我们将方案描述集中在方法学修饰和独特的实验考虑因素上，以优化乙醇的输送，最大限度地减少乙醇给药的局部和全身副作用，以及通过micro-CT / 荧光透视成像对导管树填充进行体内可视化。注射含造影剂的溶液后立即可视化导管树，可以确认完全填充或不成功的结果，例如填充不足或过量填充。该程序可用于其他烧蚀性化合物的递送和成像，旨在防止肿瘤形成或局部治疗可通过导管树进入的早期肿瘤。

Introduction

乳腺癌是一种常见且可能致命的疾病，几乎没有预防选择¹。最有效的干预措施是预防性乳房切除术;然而，只有高危人群才会选择接受这种手术，因为这是一项具有重大改变生活后果的手术²。该程序完全去除乳腺癌与周围组织一起产生的乳腺上皮细胞。这可能导致个体的身体，心理和社会压力，并且经常劝阻个体不要将这种外科手术作为其主要干预的第一线。

我们已经证明，将含有70%乙醇（EtOH）的烧蚀溶液直接递送到导管树中可有效杀死具有有限侧支组织损伤的乳腺上皮细胞并预防小鼠模型中的乳腺肿瘤³。EtOH长期以来一直被用作局部治疗的消融剂或硬化剂。经皮EtOH注射液用作不可切除的肝肿瘤，肾和肾上腺肿瘤以及胰腺囊性肿瘤的消融剂⁴^，⁵^，⁶;用于乳糜泻神经松解以减轻疼痛⁷;和用于治疗乳房假性动脉瘤⁸。血管内EtOH注射剂用作硬化剂，以消除动静脉畸形（AVM）引起的肿胀和变形，并用于蜘蛛静脉和静脉曲张的美容治疗⁹^，¹⁰^，¹¹^，¹²^，¹³。与预防性乳房切除术一样，局部递送烧蚀性溶液的成功与否取决于完全切除可能产生癌症的所有乳腺上皮细胞的能力。这需要确认烧蚀物质已成功填充导管树，从而直接接触所有乳腺上皮细胞。在乳腺内注射物质并通过图像引导的荧光透视或导管造影术进行可视化的临床手段是现成的¹⁴^，¹⁵;因此，当该程序可能需要在临床试验中进行评估时，可以交付并确认成功交付。

证明这种图像引导方法在实验动物中的可行性是确定导管内（ID）消融术作为乳腺癌预防措施的有效性和转化可行性的关键步骤。在我们的实验室中，我们已经开发出一种方法，在每周注射过程中，用含有造影剂的消融溶液成功注射小鼠的所有乳腺，以确保动物不会屈服于过量的EtOH（图1，图2，参考号³^，¹⁶）。该过程将 34 G 针头置于异氟醚麻醉小鼠的开口内以注射测试溶液。该程序的一些关键改进包括使用气密注射器治疗液体和气体，在导管树上注射更高的体积¹⁷，以及延长抗炎治疗。5 mg/kg 卡洛芬（一种非甾体抗炎药）的临床前治疗与 AVM 的临床硬化治疗一致，从 ID 手术前 2 d 至 7 d。通常，在全身麻醉后，患者在术后2天内接受抗炎药物，如NSAIDs，可以延长以减轻任何局部炎症或疼痛¹²。通过腹腔内注射小鼠的5%蔗糖溶液可显着减轻酒精中毒。通过施用这种蔗糖溶液，可以安全地向小鼠注射高达160μL的70%EtOH（最多四个导管树;血液中约0.4g / dL的EtOH含量）;动物在ID注射后4小时内完全恢复。对于在小鼠中注射超过四个腺体和/或更高的EtOH浓度，我们进行顺序会话以允许足够的恢复时间。由于酒精量占体重的比例较低，因此女性的酒精中毒将是一个较小的问题。鉴于人类乳房中导管树的数量¹⁴^，¹⁵，约16，以及估计填充每个树导管^的体积18^，¹⁹，将施用高达32mL的70%EtOH。该量将远低于其他临床程序中施用的 50 mL 95% ^EtOH4^，⁹。静脉注射硫胺素和葡萄糖溶液可用于进一步减少EtOH中毒的影响，特别是在可能需要注射更大总体积的EtOH和/或对饮酒耐受性较低的女性（例如，酒精或醛脱氢酶中的等位基因变体）的情况下。

通过显微CT /荧光透视成像使我们能够确认每个腺体的导管填充成功（图1，图2，图3）。这可以记录下来以供将来分析，或者通过实时荧光成像在当下进行评估，就像在临床应用中所做的那样，以限制对动物施加的总体辐射负担。为了进一步改进这种烧蚀溶液在体内实时图像引导递送的具体特征，我们之前将FDA批准的含碘对比与Shapiro实验室合成的含钽氧化物（_TaOx）纳米颗粒进行了比较³^，¹⁶。_TaOx作为显微CT造影剂显示出优异的性能，用于可视化导管树的初始填充（图2，图3）。_TaOx可用作参考造影剂，以对其他基于纳米颗粒的血库造影剂（例如，碘，铋或含金）以及_TaOx与不同浓度乙基纤维素作为胶凝剂的相容性进行更系统和纵向的评估²⁰^，²¹。

Protocol

这里描述的所有实验都是根据密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行的。

1. 延长抗炎治疗

确保接受含有EtOH或其他潜在刺激物的注射溶液的小鼠在注射前2天至注射后7天给予抗炎治疗。优选的给药方法是通过含有适当浓度的卡洛芬的三氯蔗糖凝胶杯口服给药。
准备所需浓度的卡洛芬。对于该实验，通过将无菌PBS稀释至0.5mL以达到每杯1mg的最终剂量，制备了2mg / mL（储备溶液为50mg / mL）的工作溶液。加入1%v / v无菌蓝色食品染料（BFD）代替稀释所需总体积的PBS的一小部分，以更好地可视化药物完全混合到三氯蔗糖凝胶中。
根据制造商的建议准备一杯用于添加卡洛芬的杯子。除非另有建议，否则将杯子置于60°C水浴中15分钟。取出杯子并晾干，以尽量减少污染的可能性。
1. 使用70%EtOH或EtOH湿巾清洁杯盖表面并晾干。使用注射器通过盖子注射必要量的卡洛芬溶液。对于该实验，注射500μL。用贴纸覆盖注射部位，用力摇晃15秒。
2. 将杯子涡旋15秒，然后在目视验证完全混合后存放以备后使用。通过寻找深蓝色团块来检查杯子的均匀混合。让杯子达到室温，然后移至冰箱储存长达一个月。
  注意：如果需要，这些杯子也可以在室温下储存，但要注意制造商的药物功效指导。贴纸的日期有助于跟踪注射日期，而不会冒着笔或锋利的记号笔刺穿盖子的风险。
准备使用时，用70%的EtOH擦拭杯子的外部。剥下盖子，将杯子与小鼠一起放入笼子中。每隔一天或空置一次杯子。一杯应该足够多达五只老鼠1-2天。

2. 术前准备

注意：此步骤将在注射前2-3天进行。

使用异氟醚汽化器（2%-3%异氟醚，1.5 L / min氧气）麻醉小鼠并涂抹眼部润滑剂。在整个手术过程中，根据需要用鼻锥保持1%-3%异氟醚的麻醉，同时仔细监测动物的呼吸频率。
在鼻锥处将眼部润滑剂涂抹在鼠标的眼睛上，然后将鼠标放在其背部。使用棉质涂抹器将非处方脱毛膏涂抹在区域（将要注射的乳腺区域）。用涂抹器将乳霜擦入该区域10-30秒，以帮助快速松弛毛发。
注意：不要将乳霜留在动物身上的时间超过必要的时间，并完全取出以避免灼伤皮肤。
涂抹10-30秒后，在纱布上使用温水完全去除奶油并松开动物的毛皮。在最后一次冲洗后用干净的干纱布擦干之前，用新鲜的纱布对该区域进行至少两到四次冲洗以去除奶油。检查毛皮去除区域，以确认良好的能见度和接触的机会。如有必要，使用脱毛膏重复上述步骤。
将鼠标放在加热垫上单独的干净，干燥的恢复笼中，以从麻醉中恢复。观察小鼠，直到它从麻醉中完全恢复，并将其放回家庭笼子。
为小鼠提供一杯含有卡洛芬的三氯蔗糖凝胶溶液（1mg /杯），用于恢复后抗炎剂的预给药。一杯可以为多达五只小鼠提供卡洛芬长达2天。每天检查杯子并根据需要更换，如果未完全食用，则每隔一天更换一次。

3. 导管内注射

注意：此步骤将在术前准备后2-3天进行。

使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）从采购的粉末配方中制备333.3mM氧化钽（_TaOx）储备溶液，如¹⁶ 中所述。如果粉末不能完全溶解到溶液中，请使用温和的温暖。
通过将三份原料_TaOx 与七份100%EtOH混合，制成烧蚀成像解决方案，最终获得70%EtOH 100mM _TaOx 溶液。在最终溶液中加入1%v / v蓝色食品染料，以便在注射期间辅助可视化。根据实验需要准备卷。
注意：腺体对1和5可以容纳高达30μL的溶液，而所有其他对可以在9周龄或更老的FVB小鼠中注射高达50μL。
像术前准备的那样用异氟醚麻醉小鼠，并在完全麻醉后将小鼠移动到鼻锥。在将动物放在背部进行注射之前，先涂抹眼部润滑剂。如果需要，请使用胶带将鼠标固定在立体镜下方。
用所需体积的注射液准备注射器。将21-51μL注射液加载到50μL注射器中，并连接34 G针头。额外加载1μL溶液，以考虑从奶嘴中取出针头后该体积的潜在泄漏。
注：以上卷适用于此处提供的典型过程。人们可以注射所需的任何体积，并了解如果分别在腺体对1和5或2-4中超过30μL或50μL，则大多数腺体将被过度填充。在注射前立即用额外体积的注射溶液填充针头以测试溶液的自由流动是有帮助的。如果注射多个乳腺，请预先填充多个注射器以节省时间。但是，不要将溶液长时间留在注射器中。
通过用细尖的镊子去除覆盖开口的任何死皮，为注射做准备。
用镊子轻轻握住。在针头的斜面可见的情况下，将针头插入开口，直到斜面在细尖镊子的引导下完全覆盖。可能需要将奶嘴拉到针头上，而不是将针头推入奶嘴（表1）。
一旦针头斜面被奶嘴完全包围并进入主导管，开始以约40μL / min的稳定速率注射溶液。避免注射太快，以确保导管树不受损。在完全注射体积后，将针头在中保持 30 秒，然后使用镊子在帮助下取出针头。这样做是为了避免溶液从奶嘴溢出（图2）。
1. 评估该区域是否有任何注射不成功的迹象。圆顶外观可能表明该区域有脂肪垫注射或创伤。
2. 继续注射剩余的乳腺。
当动物仍然麻醉时，腹腔内注射200-250μL5%蔗糖溶液（高达10 mL / kg），以尽量减少酒精中毒的潜在影响。

4. 显微CT成像

注射所有所需的腺体后，将动物迅速移动到micro-CT系统，并使用掺入的异氟醚蒸发器继续保持麻醉。可以对动物进行胶带编码以标准化成像位置。例如，将每条后腿以伸展的位置贴上胶带有助于使动物的腿骨远离所得到的图像中感兴趣的下腺体。
注意：如果注意确定动物的适当可接受的终生辐射剂量并且累积剂量不超过此水平，则可以使用不同的扫描参数对动物进行成像，以可视化导管树。无需执行扫描即可生成荧光透视静止图像和视频，以进一步减少辐射暴露（图2）。
使用荧光透视预览功能将鼠标放置在适当的视野中。
以良好的分辨率对小鼠导管树进行_TaOx 成像，并有机会进行重复的标准（2分钟）采集扫描。使用以下扫描参数：90 kVp/88 μA;视场，36毫米;切片数，512;切片厚度，72μm;体素分辨率，72 ^μm3。
1. 获取更长（4 或 14 分钟）的高分辨率扫描，以获得更好的动物分辨率。这些可以作为安乐死前的终末期程序。然而，对于使用与辐射病相同的参数对动物进行纵向扫描是不可接受的。
成像方案完成后，将动物从麻醉中取出，转移到加热垫上单独的清洁，干燥的恢复笼中。观察动物直到完全恢复，然后将其放回家庭笼子。保持动物注射烧蚀溶液在卡洛芬直到注射后7天。
在micro-CT软件（内置系统）中对任何扫描图像进行快速再现，以更好地了解任何对比度泄漏或缺乏填充（图2），而无需进行正式分析。
执行进一步的正式图像分析以进行发布或扫描的详细分析，如果需要，可以分割感兴趣的区域（图3）。
注意：这些方法之间的主要区别在于能够仅阈值导管树（正式呈现形式）与需要阈值化整个图像（快速呈现形式）。可以使用软件包生成其他测量和图像，以最好地展示导管树填充的成功。

5. 图像分析

使用专用软件包对注入的导管树执行渲染。为此，请通过进一步的图像处理来分割乳腺脂肪垫。
1. 要分割包含感兴趣导管树的脂肪垫（与腹膜腔、股骨肌肉和皮肤相比，隔间较暗），请从手动菜单中选择" 样条曲线追踪 "选项。跟踪每三个数据切片的胖垫轮廓。
2. 单击半自动菜单中的" 传播对象" 选项，将所有跟踪和未跟踪切片连接到单个对象中。
从半自动菜单中选择"阈值音量"选项以输入所需的 HU 范围（300-3，000 HU 是一个很好的起点），然后单击"阈值呈现形式"按钮以创建仅显示导管树内的对比度（TaOx）并消除软组织的呈现形式。
将" 视图 "按钮切换为" 呈现形式"为"主要 "，以仅查看 3D 呈现形式而不查看周围结构。
注：附加软件功能允许对 3D 再现进行测量（即长度、体积等）。

Representative Results

雌性小鼠有五对乳腺，其中一根导管树在孔处打开 ²² 。在发育中的导管树的尖端是末端末端芽（TEBs），这是指导生长和分支的增殖结构。青春期后，当伸长期结束时，TEBs会退步，并且在功能和解剖学上与末端导管或肺泡芽无法区分²³。终末导管小叶单元在人类中的作用与TEBs在小鼠中的作用相似，并且是乳腺癌主要产生的部位²⁴^，²⁵。我们可以注射多达50μL的70%EtOH溶液，以填充9周龄FVB / N，NSG和其他小鼠品系的胸腔和腹部乳腺的整个导管树（图1，图2，图3，见参考文献³^，¹⁶）。在典型的实验中，我们可以在两个连续的ID程序中注射多达8个乳腺，其中70%EtOH和100mM _TaOx 的消融溶液相隔7天，以允许动物恢复（图2）。在最后一次ID注射后立即通过micro-CT对动物进行成像，以评估溶液成功输送到整个导管树（图2）。根据我们的经验，腹股沟腺的适合注射约 60% 的动物，宫颈腺的适合注射约 40% 。在合适的情况下，我们可以注射多达30μL的70%EtOH溶液，以填充宫颈和腹股沟乳腺的整个导管树（图2）。FVB 和 NSG 菌株通常比 C57BL / 6J 或混合遗传背景菌株更适合注射。全安装双染色方案或3D共聚焦显微镜是确认导管树填充程度的良好正交方法（图3）。这些组织相关分析与体内成像兼容，并且可以 在体内 成像后进行。这些正交方法的明显局限性在于它们需要动物终止以进行组织收集和分析;然而，在新烧蚀配方的优化阶段，它们提供了独立的验证。

图1：导管内程序和图像分析的工作流程。突出显示了 ID 过程的关键步骤。有关更多详细信息，请参阅视频。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：成功插管并将烧蚀溶液输送到多个乳腺。（ A ） FVB 和 NSG 小鼠品系中的代表性变异。长比短更容易插管，而太短或残留的不能插管。一旦插管，的大小不会影响引管内的成功分娩。（B）烧蚀溶液中蓝色染料的粗略解剖学分析提供了导管树填充和递送成功的离体证据。（C，D）实时荧光透视和图像采集后3D micro-CT再现提供了递送成功的体内证据。（D）成功注射腹部和腹股沟腺，以及四分之三的胸腺（腺体#2中的脂肪垫注射）。比例尺对应于不同放大倍率下图像中的1毫米。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：导管树填充的体内和离体演示。将70%EtOH / 100 mM _TaOx纳米颗粒/Evans Blue溶液导管注射到小鼠腹腔乳腺中，并立即通过micro-CT成像并进行双全贴装染色。使用图像分析软件包重建导管树。该溶液完全填充胭脂红明矾染色的导管树。对E-钙粘蛋白（Cdh1）的单独腺体进行免疫染色，使用苯甲醇：苯甲酸苄酯清除，并通过共聚焦显微镜成像，如所述²⁶。使用图像分析软件重建导管树。利用图像编辑软件的图像反转功能，获得了共聚焦图像的伪着色渲染（即，黑色背景为白色，绿色标记信号为洋红色）。比例尺对应于不同放大倍率下图像中的1毫米。该图已从第^{3号参考资料中修改而来}。请点击此处查看此图的放大版本。

问题	外观	溶液
短奶嘴（图 2）	奶嘴外形低调 – 难以抓取	有时更容易将皮肤保持在附近，并用针头瞄准的中心。针头可能会潜入皮肤下。缓慢向上拉可能会显示略微超过针尖，并留出空间将其其余部分抓住并拉到针头上。在皮肤下方潜水时，要非常小心针头的角度。很容易通过以错误的角度刺伤而无意中得到脂肪垫注射。
胖	比其他大得多，几乎没有可剥离的死皮 - 无需示波器即可轻松看到	很容易在这些上注射脂肪垫。插入奶嘴时，要非常小心针头的角度。
脂肪垫注射（图2）	周围肿胀，可能在本身肿胀 - 最容易看到注射液中是否添加了颜色	如果肿胀，前几个 ul 注射，取出针头，并尝试再次插入，并更加小心角度。再次开始注射，并观察进一步的肿胀。如果肿胀持续，请放弃尝试。成功注射一个开始作为脂肪垫注射的是非常罕见的。
伤口/结痂	EtOH溶液注射部位附近的开放性伤口或结痂	在开放性伤口上涂抹三重抗生素软膏，但不要单独留下结痂的伤口。在结痂上涂抹软膏会增加动物打扰结痂并将其去除的可能性。每1-2天检查一次，直到愈合，具体取决于伤口的严重程度。卡洛芬应给予直至愈合，即使超出正常窗口。

表 1：故障排除和有用提示。

Discussion

预防性乳房切除术是目前乳腺癌最有效的干预措施，但它有一些严重的负面影响。使用基于EtOH的解决方案局部消融乳腺上皮细胞是一种有前途的替代疗法，正如我们在乳腺癌侵袭性FVB-Tg-C3（1）-TAg小鼠模型的概念验证研究中所证明^的那样3。这种烧蚀性溶液的ID注射允许靶向乳腺癌产生的乳腺上皮细胞，而附带损害有限。在烧蚀溶液中添加X射线造影剂可以增强对溶液预防有效性的理解，因为我们可以看到注射后是否成功填充了每个导管树（图2B）。注射后立即通过透视观察注射的腺体反映了临床上可能采取的措施，以确认导管树的成功填充。解决方案交付的视觉确认将最好地告知是否已实时到达树的所有部分。这可以允许在当时或将来的会话中执行进一步的注入以完成填充。烧蚀性溶液到达导管树的所有部分是非常重要的，以确保所有上皮细胞都可以被访问以进行杀伤（图3）。在树内留下活的上皮细胞将允许乳腺癌仍然可能出现。利用ID注射中的对比度来成像注射的成功也可能对其他配方有用。表 1 提供了故障排除和有用的提示。其他研究描述了小鼠中病毒颗粒（例如AdCre，CRISPR引导RNA），激素，细胞毒性化合物，siRNA和/或靶向剂的ID递送方案³^，¹⁶，27^，²⁸^，²⁹^，^30，31^，³²^，³³^，³⁴^，³⁵^，³⁶^，³⁷^，³⁸，大鼠²⁴^，³²^，³⁹^，⁴⁰^，⁴¹和兔子⁴²^，⁴³^，⁴⁴^，⁴⁵^，⁴⁶^，⁴⁷。独立临床研究报告，每个乳房成功插管多达 8 根导管，用于局部化疗⁴⁰^，⁴⁸^，⁴⁹。出于类似的原因，在提供其他旨在预防或面向治疗的解决方案时，可视化完全填充是值得的。了解解决方案已到达树的所有分支和末端，将有助于评估成功的预防或治疗。

我们不知道在小鼠³³^，³⁴ 或其他动物模型⁴⁷ 中的任何其他导管内成像方法能够提供_TaOx 纳米颗粒的高分辨率。值得注意的是，小鼠导管树中的_TaOx 在诊断性导管造影方面优于FDA批准的造影剂³^，¹⁶。随着我们继续评估ID消融手术预防乳腺癌的能力，我们将能够更准确地确定ID交付后通过成像给出的附加数据，从哪个腺癌中产生。例如，人们可以确定仅部分填充的腺体是否比未注射的腺体更有可能导致肿瘤形成，这解决了高风险女性注射失败的安全性问题。此技术有一些限制。这是一种相对具有挑战性的鼠标技术，需要操作员的灵巧和熟练程度来操纵和成功插管每个管道。每次单独注射都是一个独立的事件，因此在一个或多个腺体上不成功的注射可能会损害结果的解释。鉴于小鼠乳腺的大小和的脆弱性，透视或类似的图像引导技术无法实时告知何时停止输注。这种实时图像引导将是临床实施局部递送烧蚀性解决方案的要求。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作部分得到了国家癌症研究所R21 CA226579和R01 CA258314对LFS的资助，以及国家生物医学成像和生物工程研究所R01 EB029418对EMS的资助。我们要感谢密歇根州立大学定量（IQ）健康科学与工程成像研究所核心设施使用其成像系统和技术专长。我们要感谢Danielle Ferguson博士审查了视频的内容以及遵守动物福利指南的数字。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnalyzeDirect v12.0	Caliper	n/a	For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL	Allivet	50647	For anti-inflammatory treatment
Evans blue	Sigma	E2129-50G	For injection visualization
Hot water bath	Toolots	Yidu_HH-S2	For preparing carprofen cups
Imaris	Bitplane	n/a	For confocal image processing
MediGel Sucralose Cups	ClearH2O	74-02-5022	For delivery of carprofen
Model 1705 RN Syringe, 50μL	Hamilton	7655-01	For intraductal injection
Photoshop 2021	Adobe	n/a	For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System	Perkin Elmer	CLS149276	For micro-CT image acquisition
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4)	Hamilton	207434	For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series	AmScope	SM-4TPZ-144	For intraductal injection
Sterile blue food dye	McCormick	930641	For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	14190250	For solution preparation
Stickers	DOT Scientific	DOTSCI-C50	For preparing carprofen cups
Sucrose	Calbiochem	8550-5KG	For intraductal injection
Syringes	Fisher	14-826-79	For preparing carprofen cups
Vortex	VWR	10153-834	For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	For intraductal injection/preoperative preparation