Summary
Um método de injeção intradutal de reagentes para uma solução ablativa à base de etanol para a árvore ductal mamária do camundongo para a imagem in vivo e prevenção do câncer de mama é descrito. A injeção diretamente na abertura do mamilo permite atingir células epiteliais mamárias com danos colaterais mínimos.
Abstract
O câncer de mama é o câncer mais prevalente e a segunda causa de morte relacionada ao câncer para mulheres nos EUA. Para mulheres de alto risco, a mastectomia profilática é a estratégia de prevenção primária mais eficaz. A mastectomia profilática é um procedimento cirúrgico agressivo que remove completamente as células epiteliais mamárias das quais o câncer de mama surge junto com o tecido circundante. Buscamos desenvolver um procedimento intradutal minimamente invasivo como alternativa à mastectomia profilática para abolar localmente as células epiteliais mamárias antes que elas possam se tornar malignas. Nós e outros desenvolvemos um procedimento de parto intradutor para alcançar e tratar essas células epiteliais em modelos de roedores de câncer de mama. Enquanto a glândula mamária do rato com uma única abertura de árvore ductal não anastomosa no mamilo tem uma arquitetura muito menos complexa e tortuosa do que a mama humana, modelos de camundongos quimicamente induzidos e geneticamente modificados de câncer de mama são valiosos para produzir estudos de prova de conceito de novas estratégias preventivas. Aqui, descrevemos um procedimento para a entrega intradutal de uma solução ablativa à base de etanol contendo agente de contraste à base de tântalo micro-CT/raios-X dentro da árvore ductal mamária do camundongo para fins terapêuticos de prevenção primária do câncer de mama. A entrega intradutora de reagentes aquosos (por exemplo, compostos citotóxicos, siRNAs, AdCre) foi descrita anteriormente em modelos de camundongos. Assim, focamos nossa descrição protocolar em modificações metodológicas e considerações experimentais únicas para a otimização da entrega de etanol, para minimizar os efeitos colaterais locais e sistêmicos da administração do etanol e para a visualização in vivo do enchimento de árvores ductais via micro-CT/fluoroscopia. A visualização da árvore ductal imediatamente após a injeção de uma solução contendo contraste permite a confirmação de preenchimento completo ou desfechos mal sucedidos, como enchimento ou sobresso. Este procedimento pode ser aplicado para o parto e imagem de outros compostos ablativos destinados a prevenir a formação de tumores ou tratar localmente tumores em estágio inicial acessíveis através da árvore ductal.
Introduction
O câncer de mama é uma doença comum e potencialmente letal, com poucas opções disponíveis para prevenção1. A intervenção mais eficaz é a mastectomia profilática; no entanto, apenas indivíduos de alto risco optam por se submeter a esse procedimento, pois é uma cirurgia com grandes consequências que mudam a vida2. O procedimento remove completamente as células epiteliais mamárias das quais o câncer de mama surge junto com o tecido circundante. Isso pode resultar em estresse físico, psicológico e social para o indivíduo, e muitas vezes dissuade os indivíduos de prosseguir com este procedimento cirúrgico como sua primeira linha de intervenção primária.
Demonstramos que a entrega de uma solução ablativa contendo 70% de etanol (EtOH) diretamente na árvore ductal é eficaz na morte de células epiteliais mamárias com danos colaterais limitados no tecido colateral e na prevenção de tumores mamários em modelos de camundongos3. O ETOH tem sido usado clinicamente por muito tempo como um agente ablativo ou esclero para tratamento local. A injeção de EtOH percutâneo é usada como agente ablativo para tumores hepáticos não ressecáveis, neoplasias renais e adrenais e tumores cisticísticos pancreáticos4,5,6; para neurolise celíaca plexo para reduzir a dor7; e para tratar pseudoaneurysms 8 mama. A injeção de EtOH intravascular é usada como agente esclero para eliminar o inchaço e a deformação das malformações arteriovenosas (AVM) e para tratamento cosmético de veias de aranha e varizes9,10,11,12,13. Como a mastectomia profilática, o sucesso da prevenção com a entrega local de uma solução ablativa depende da capacidade de remover completamente todas as células epiteliais mamárias das quais o câncer poderia potencialmente surgir. Isso requer a confirmação de que a substância ablativa preencheu com sucesso a árvore ductal, entrando em contato diretamente com todas as células epiteliais mamárias. Os meios clínicos para injetar substâncias dentro das glândulas mamárias e visualizá-las por fluoroscopia ou ductografia guiadas por imagem estão prontamente disponíveis14,15; portanto, será possível entregar e confirmar a entrega bem sucedida quando este procedimento pode justificar a avaliação em ensaios clínicos.
Demonstrar a viabilidade dessa abordagem guiada por imagens em animais de laboratório é um passo fundamental para estabelecer a eficácia e a viabilidade translacional da ablação intradutal (ID) como medida preventiva para o câncer de mama. Em nosso laboratório, desenvolvemos um método para injetar com sucesso todas as glândulas mamárias em camundongos com uma solução ablativa contendo um agente de contraste ao longo de um curso de injeções semanais para garantir que o animal não sucumba a uma overdose de EtOH (Figura 1, Figura 2, referência n.3,16). Este procedimento coloca uma agulha de 34 G dentro da abertura do mamilo de um rato isoflurane-anesthetizado para injetar a solução de teste. Algumas melhorias fundamentais do procedimento incluem o uso de seringas gastight para líquidos e gases, injeção de maiores volumes por árvores ductais17 e tratamento anti-inflamatório prolongado. O tratamento pré-clínico de 5 mg/kg de carprofeno, um NSAID, de 2 d antes de 7 d após o procedimento de IDENTIDADE está em consonância com o da terapia clínica de esclerose para AVM. Normalmente, após anestesia sistêmica, os pacientes recebem medicamentos anti-inflamatórios, como NSAIDs, durante 2 dias após o procedimento que podem ser estendidos para mitigar qualquer inflamação local ou dor12. A intoxicação alcoólica é significativamente atenuada pela injeção intraperitoneal de uma solução de sacarose de 5% em camundongos. Com a administração desta solução de sacarose, os camundongos podem ser injetados com segurança com até 160 μL de 70% etoh (até quatro árvores ductais; cerca de 0,4 g/dL de conteúdo EtOH no sangue); animais totalmente recuperados dentro de 4 horas após injeções de ID. Para a injeção de mais de quatro glândulas em camundongos e/ou concentrações etoh mais altas, realizamos sessões sequenciais para permitir tempo suficiente de recuperação. A intoxicação por álcool em mulheres seria uma preocupação menor devido à menor proporção de álcool no peso corporal. Dado o número de árvores ductais em mama humana14,15, cerca de 16, e volume estimado para encher cada duto de árvore18,19, até 32 mL de 70% de EtOH serão administrados. Essa quantidade será muito inferior aos 50 mL de 95% de EtOH administrados em outros procedimentos clínicos4,9. A administração intravenosa da solução de tiamina e glicose poderia ser usada para minimizar ainda mais os efeitos da intoxicação etoh, especialmente nos casos em que um volume total maior de EtOH pode precisar ser injetado e/ou para mulheres que têm uma menor tolerância ao consumo de álcool (por exemplo, variantes allelic em álcool ou desidrogenases aldeídas).
A imagem via micro-CT/fluoroscopia nos permite confirmar o preenchimento ductal bem sucedido de cada glândula (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Isso pode ser registrado para análise futura, ou avaliado no momento através de imagens de fluoroscopia em tempo real, como seria feito na aplicação clínica, para limitar a carga global de radiação imposta ao animal. Para melhorar ainda mais as características específicas desta solução ablativa para entrega guiada por imagem em tempo real in vivo, comparamos anteriormente o contraste contendo iodo aprovado pela FDA a um óxido de tântalo (TaOx) sintetizado pelo laboratório Shapiro3,16. TaOx mostrou desempenho superior como agente de contraste micro-CT para visualizar o preenchimento inicial da árvore ductal (Figura 2, Figura 3). TaOx pode ser usado como um contraste de referência para realizar uma avaliação mais sistemática e longitudinal de outros agentes de contraste da piscina de sangue à base de nanopartículas (por exemplo, iodo-, bismuto-ou contendo ouro) e compatibilidade de TaOx com diferentes concentrações de celulose etil como agente de gelagem20,21.
Protocol
Todos os experimentos descritos aqui foram conduzidos sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Michigan.
1. Tratamento anti-inflamatório prolongado
- Certifique-se de que os camundongos que recebem soluções de injeção contendo EtOH ou outros potenciais irritantes são fornecidos com tratamento anti-inflamatório de 2 dias antes da injeção para 7 dias após a injeção. O método preferido de dosagem é a entrega oral através de um copo de gel sucralose contendo carprofeno em uma concentração apropriada.
- Prepare o carprofeno com a concentração necessária. Para este experimento, uma solução de trabalho de 2 mg/mL (Solução de estoque é de 50 mg/mL) foi preparada por diluição em PBS estéril para injetar 0,5 mL para alcançar uma dose final de 1 mg por xícara. Adicione 1% v/v de corante alimentar azul estéril (BFD) no lugar de uma fração do PBS do volume total necessário para diluição para melhor visualizar a mistura completa da droga no gel de sucralose.
- Prepare um copo para adição de carprofeno de acordo com a recomendação do fabricante. A menos que recomende o contrário, coloque o copo em banho-maria de 60 °C por 15 minutos. Retire os copos e seque-os para minimizar a possibilidade de contaminação.
- Use 70% de EtOH ou uma limpeza EtOH para limpar a superfície da tampa do copo e deixe secar. Use uma seringa para injetar a quantidade necessária de solução de carprofeno através da tampa. Para este experimento, 500 μL é injetado. Cubra o local da injeção com um adesivo e agite vigorosamente por 15 s.
- Vórtice o copo para 15 s e, em seguida, armazene para uso posterior após verificar visualmente a mistura completa. Verifique se há misturas homogêneas procurando por aglomerados azuis escuros. Deixe os copos entrarem em temperatura ambiente antes de se mudarem para a geladeira para armazenamento por até um mês.
NOTA: Estes copos também podem ser armazenados à temperatura ambiente uma vez dosados, se necessário, mas tome cuidado para prestar atenção à orientação de eficácia da droga do fabricante. Namorar o adesivo ajuda a manter o controle da data da injeção sem arriscar uma caneta ou marcador afiado perfurando a tampa.
- Quando estiver pronto para usar, limpe o exterior do copo com 70% de EtOH. Retire a tampa e coloque o copo na gaiola com os ratos. Substitua os copos a cada dois dias ou quando estiver vazio. Uma xícara deve ser suficiente para até cinco ratos por 1-2 dias.
2. Preparação pré-operatória
NOTA: Esta etapa ocorrerá 2-3 dias antes da injeção.
- Anestesiar o rato usando um vaporizador de isoflurane (2%-3% isoflurane, 1,5 L/min de oxigênio) e aplicar lubrificante ocular. Mantenha a anestesia em 1%-3% de isoflurane conforme necessário durante todo o procedimento com um cone de nariz enquanto monitora cuidadosamente a taxa respiratória do animal.
- Aplique o lubrificante dos olhos nos olhos do rato enquanto estiver no cone do nariz e, em seguida, posicione o mouse sobre as costas. Use um aplicador de ponta de algodão para aplicar creme depilatório over-the-counter na área do mamilo (a área da glândula mamária que será injetada). Esfregue o creme na área por 10-30 s com o aplicador para ajudar a soltar a pele rapidamente.
NOTA: Não deixe o creme sobre o animal por mais tempo do que o necessário e remova completamente para evitar queimar a pele. - Após 10-30 s da aplicação, use água morna na gaze para remover completamente o creme e soltar a pele do animal. Realize pelo menos duas a quatro enxágues da área com gaze fresca para remoção de creme antes de secar com uma gaze seca limpa após a lavagem final. Verifique a área de remoção de peles para confirmar boa visibilidade e acesso aos mamilos. Repita com a aplicação do creme depilatório, se necessário.
- Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa e seca separada em uma almofada de aquecimento para se recuperar da anestesia. Observe o rato até que ele tenha se recuperado totalmente da anestesia e devolva-o para a gaiola doméstica.
- Forneça aos camundongos uma xícara de solução de gel sucralose contendo carprofeno (1 mg/xícara) para pré-dosagem do anti-inflamatório após a recuperação. Uma xícara pode fornecer até cinco ratos com carprofeno por até 2 dias. Verifique o copo diariamente e substitua conforme necessário, ou a cada dois dias, se não estiver totalmente consumido.
3. Injeção intraducional
NOTA: Esta etapa ocorrerá de 2 a 3 dias após a preparação pré-operatória.
- Prepare a solução de estoque de óxido de tântalo de 333,3 mM (TaOx) a partir da formulação de pó adquirido, conforme descrito em 16 utilizando salina tamponada de fosfato (PBS). Use calor suave se o pó não se dissolver totalmente na solução.
- Faça uma solução de imagem ablativa misturando três partes de estoque TaOx com sete partes 100% EtOH para uma solução Final 70% EtOH 100mM TaOx . Adicione 1% de corante alimentar azul v/v à solução final para visualização auxiliada durante a injeção. Prepare um volume baseado na necessidade do experimento.
NOTA: Os pares de glândulas 1 e 5 podem conter até 30 μL da solução, enquanto todos os outros pares podem ser injetados com até 50 μL em 9 semanas de idade ou camundongos FVB mais velhos. - Anestesiar o rato com isoflurane como preparação pré-operatória e mover o rato para o cone do nariz uma vez totalmente anestesiado. Aplique lubrificante ocular antes de colocar o animal nas costas para a injeção. Fixar o mouse sob o estereoscópio usando fita adesiva, se necessário.
- Prepare a seringa com o volume desejado de solução de injeção. Carregue 21-51 μL da solução de injeção em uma seringa de 50 μL com uma agulha de 34 G presa. Carregue mais 1 μL da solução para explicar o possível vazamento desse volume após a retirada da agulha do mamilo.
NOTA: Os volumes acima são para os procedimentos típicos aqui apresentados. Pode-se injetar qualquer volume desejado com o entendimento de que a maioria das glândulas será superabastecada se ultrapassar 30 μL ou 50 μL nos pares de glândulas 1 e 5, ou 2-4, respectivamente. É útil encher a agulha com volume adicional da solução de injeção para testar o fluxo livre da solução imediatamente antes da injeção. Se injetar mais de uma glândula mamária, preenche várias seringas para economizar tempo. No entanto, não deixe a solução na seringa por muito tempo. - Prepare os mamilos para a injeção removendo qualquer pele morta que cubra a abertura do mamilo com fórceps pontiagudas finos.
- Segure o mamilo suavemente com pinças. Com o bisel da agulha visível, insira a agulha na abertura do mamilo até que o bisel esteja totalmente coberto com orientação de fórceps finos. Pode ser necessário puxar o mamilo para cima da agulha em vez de empurrar a agulha para dentro do mamilo (Tabela 1).
- Uma vez que o chanfrado da agulha esteja totalmente cercado pelo mamilo e esteja no duto principal, comece a injetar a solução a uma taxa constante de aproximadamente 40 μL/min. Evite injetar muito rapidamente para garantir que a árvore ductal não seja danificada. Mantenha a agulha no mamilo por 30 s depois que o volume for completamente injetado antes de remover a agulha com assistência usando os fórceps. Isso é feito para evitar que a solução saia do mamilo (Figura 2).
- Avalie a área para qualquer sinal de injeção mal sucedida. Uma aparência de domed pode indicar uma injeção de almofada de gordura ou trauma na área.
- Prossiga para injetar as glândulas mamárias restantes.
- Enquanto o animal ainda é anestesiado, injete 200-250 μL de solução de sacarose de 5% (até 10 mL/kg) intraperitoneally para minimizar os efeitos potenciais da intoxicação alcoólica.
4. micro-tomografia
- Depois de injetar todas as glândulas desejadas, mova o animal rapidamente para o sistema micro-CT e continue a manter a anestesia usando o vaporizador de isoflurane incorporado. O animal pode ser gravado para padronizar a posição de imagem. Por exemplo, gravar cada perna traseira em uma posição estendida ajuda a manter os ossos da perna do animal mais longe das glândulas inferiores de interesse na imagem resultante.
NOTA: Os animais podem ser imagens usando diferentes parâmetros de varredura para a visualização da árvore ductal se for tomado cuidado para determinar uma dose adequada de radiação ao longo da vida para o animal e as doses cumulativas não excedem esse nível. Imagens e vídeos de fluoroscopia podem ser gerados sem a realização de varreduras para reduzir ainda mais a exposição à radiação (Figura 2). - Posicione o mouse no campo de visão apropriado com a função de visualização da fluoroscopia.
- Realize imagens taOx da árvore ductal do rato com boa resolução e oportunidade para varreduras de aquisição padrão repetidas (2 min). Utilize os seguintes parâmetros de varredura: 90 kVp/88 μA; campo de visão (FOV), 36 mm; número de fatias, 512; espessura da fatia, 72 μm; resolução voxel, 72 μm3.
- Adquira exames de alta resolução (4 ou 14 minutos) para uma resolução ainda melhor em animais. Estes são aceitáveis como procedimentos terminais antes da eutanásia. Estes, no entanto, não são aceitáveis para que os animais sejam escaneados longitudinalmente usando os mesmos parâmetros que causarão doenças de radiação.
- Após a conclusão do protocolo de imagem, remova o animal da anestesia e transfira para uma gaiola de recuperação limpa e seca separada em uma almofada de aquecimento. Observe o animal até que esteja totalmente recuperado e, em seguida, devolva-o para a gaiola. Mantenha os animais injetados com solução ablativa em carprofeno até 7 dias após a injeção.
- Faça representações rápidas de qualquer imagem digitalizada dentro do software micro-CT (incorporado no sistema) para apreciar melhor quaisquer vazamentos de contraste ou falta de enchimento (Figura 2) sem análise formal.
- Realizar mais análises formais de imagem para publicação ou análise detalhada de exames que permitam a segmentação da área de interesse, se desejar (Figura 3).
NOTA: A principal diferença entre esses métodos será a capacidade de limiar apenas da árvore ductal (rendição formal) versus a necessidade de limiar de toda a imagem (rendição rápida). Outras medidas e imagens podem ser geradas usando os pacotes de software para demonstrar melhor o sucesso do enchimento de árvores ductais.
5. Análise de imagem
- Realize a renderização da árvore ductal injetada usando um pacote de software especializado. Para isso, segmente a almofada de gordura mamária com mais processamento de imagem.
- Para segmentar a almofada de gordura (compartimento mais escuro em comparação com a cavidade peritoneal, músculos femorais e pele) dentro da qual a árvore ductal de interesse está contida, selecione a opção Spline Trace do menu manual. Rastreie o contorno do bloco de gordura em cada terceira fatia de dados.
- Clique na opção Propagar Objetos no menu semiautomático para conectar todas as fatias rastreadas e não rastreadas em um único objeto.
- Selecione a opção Volume de Limiar no menu semiautomático para inserir a faixa HU desejada (300-3.000 HU é um bom ponto de partida) e clique no botão Rendição limiar para criar uma representação que só exibe o contraste (TaOx) dentro da árvore ductal e elimina o tecido mole.
- Alterne o botão Exibir para Rendição como Primário para visualizar apenas a rendição 3D sem estruturas circundantes.
NOTA: Recursos adicionais de software permitem que as medições sejam feitas da rendição 3D (ou seja, comprimento, volume, etc.).
Representative Results
Camundongos fêmeas têm cinco pares de glândulas mamárias com uma única árvore ductal que abre no orifício do mamilo22. Nas pontas da árvore ductal em desenvolvimento estão os botões finais terminais (TEBs), estruturas proliferativas que direcionam o crescimento e o ramificação. Após a puberdade, quando a fase de alongamento é concluída, os TEBs regridem e se tornam funcional e anatomicamente indistinguíveis de dutos terminais ou brotos alveolares23. Unidades lobulares ductais terminais servem a uma função semelhante em humanos como os TEBs fazem em camundongos e são os locais de onde o câncer de mama surge predominantemente24,25. Podemos injetar até 50 μL de solução etoh de 70% para encher toda a árvore ductal de glândulas mamárias torácicas e abdominais de FVB/N, NSG e outras cepas de camundongos de 9 semanas de idade (Figura 1, Figura 2, Figura 3, ver referências3,16). Em um experimento típico, podemos injetar até oito glândulas mamárias com uma solução ablativa de 70% de EtOH e 100 mM TaOx em dois procedimentos de identidade consecutivos separados por 7 dias para permitir a recuperação animal (Figura 2). Os animais são imagens por micro-TC imediatamente após a última injeção de IDENTIDADE para avaliar a entrega bem sucedida da solução para toda a árvore ductal (Figura 2). Em nossa experiência, os mamilos das glândulas inguinais são adequados para injeção em cerca de 60% dos animais, e os mamilos das glândulas cervicais em cerca de 40%. Quando adequado, podemos injetar até 30 μL de solução etoh de 70% para encher toda a árvore ductal das glândulas mamárias cervicais e inguinais (Figura 2). As cepas FVB e NSG geralmente apresentam mamilos mais adequados para injeção do que c57BL/6J ou cepas de fundo genético misto. O protocolo de coloração dupla de montagem total ou microscopia confocal 3D são bons métodos ortogonais para confirmar até que ponto a árvore ductal foi preenchida (Figura 3). Essas análises correlacionarem tecidos são compatíveis e podem ser realizadas após a imagem in vivo. A limitação óbvia desses métodos ortogonais é que eles requerem o término animal para coleta e análise de tecidos; no entanto, em uma fase de otimização de uma nova formulação ablativa, eles fornecem validação independente.
Figura 1: Fluxo de trabalho do procedimento intradutor e análise de imagem. As principais etapas do procedimento de ID são destacadas. Por favor, veja o vídeo para mais detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cannulação bem sucedida e entrega de solução ablativa para múltiplas glândulas mamárias. (A) Variação representativa do mamilo nas cepas de camundongos FVB e NSG. Mamilos longos são mais fáceis de se anuladas do que mamilos curtos, enquanto mamilos muito curtos ou vestigiais não podem ser cânulados. Uma vez cânulado, o tamanho do mamilo não afeta o bem sucedido parto intradutal. (B) A análise anatômica grosseira do corante azul em uma solução ablativa fornece evidências ex vivo de enchimento e entrega de árvores ductais. (C,D) Fluoroscopia em tempo real e aquisição de microcscopia pós-imagem fornecem evidências in vivo de sucesso de entrega. (D) Injeção bem sucedida de ambas as glândulas abdominais e inguinais, e três de quatro glândulas torácicas (injeção de almofada de gordura na glândula #2). As barras de escala correspondem a 1 mm em imagens em diferentes ampliações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Demonstração in vivo e ex vivo de enchimento de árvore ductal. 70% EtOH/100 mM Nanopartículas TaOx /Evans A solução azul foi injetada intradutalmente na glândula mamária abdominal do camundongo e imediatamente visualizada por micro-CT e processada para coloração de montagem dupla. A árvore ductal foi reconstruída usando um pacote de software de análise de imagens. A solução preenche inteiramente a árvore ductal manchada de carmim. Uma glândula separada foi imunos detida para E-Cadherin (Cdh1), liberada usando álcool benzílico:Benzyl Benzoate e imageada por microscopia confocal como descrito26. A árvore ductal foi reconstruída por meio de um software de análise de imagem. A renderização pseudocolorida da imagem confocal (ou seja, fundo preto para branco, sinal de marcador verde para magenta) foi obtida com a função de inverter de imagem do software de edição de imagens. As barras de escala correspondem a 1 mm em imagens em diferentes ampliações. Este valor foi modificado a partir da referência nº 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Questão | Aparência | Solução | |||
| Mamilo curto (Fig. 2) | Mamilo tem baixo perfil – difícil de agarrar | Às vezes é mais fácil segurar a pele perto do mamilo e atingir o centro do mamilo com a agulha. A agulha provavelmente mergulhará sob a pele. Puxar para cima lentamente pode revelar que o mamilo está ligeiramente acima da ponta da agulha e dar espaço para agarrar e puxá-lo o resto do caminho para a agulha. Tenha muito cuidado ao mergulhar abaixo da pele sobre o ângulo da agulha. É fácil inadvertidamente obter uma injeção de almofada de gordura esfaqueando no ângulo errado. | |||
| Mamilo gordo | Muito maior do que outros mamilos com pouca pele morta descascada – facilmente visível sem escopo | Muito fácil obter uma injeção de almofada de gordura nestes mamilos. Tenha muita cautela quanto ao ângulo da agulha ao inserir no mamilo. | |||
| Injeção de almofada de gordura (Fig. 2) | Inchado ao redor do mamilo e possivelmente no próprio mamilo – mais fácil de ver se a cor é adicionada à solução de injeção | Se o mamilo estiver inchando com os primeiros ul injetados, remova a agulha e tente inserir novamente com mais cuidado com o ângulo. Comece a injeção novamente e observe para mais inchaço. Se o inchaço continuar, abandone a tentativa. É muito raro injetar com sucesso um mamilo que começou como uma injeção de almofada de gordura. | |||
| Feridas/escamos | Abrir ferida ou escabbing perto do local de injeção da solução EtOH | Aplique pomada com antibiótico triplo para abrir feridas, mas deixe feridas com bainha em paz. Aplicar pomada em cicatrizes pode aumentar a probabilidade de o animal incomodar a crosta e removê-la. Verifique a cada 1-2 dias até curar dependendo da gravidade da ferida. Carprofen deve ser dado até curar, mesmo que além da janela normal. | |||
Tabela 1: Solução de problemas e dicas úteis.
Discussion
A mastectomia profilática é atualmente a intervenção mais eficaz para o câncer de mama, mas tem alguns impactos negativos graves. A ablação local de células epiteliais mamárias com uma solução baseada em EtOH é uma terapia alternativa promissora, como demonstramos em um estudo de prova de conceito sobre o agressivo modelo de camundongo fvb-tg-C3(1)-TAg do câncer de mama3. A injeção de ID desta solução ablativa permite o direcionamento das células epiteliais mamárias das quais o câncer de mama surge com danos colaterais limitados. A adição de um agente de contraste de raios-X à solução ablativa permite uma compreensão aprimorada da eficácia da solução na prevenção, pois podemos ver se cada árvore ductal é preenchida com sucesso após a injeção (Figura 2B). Visualização de glândulas injetadas por fluoroscopia imediatamente pós-injeção espelha o que provavelmente será feito na clínica para confirmar o preenchimento bem sucedido da árvore ductal. A confirmação visual da entrega da solução informará melhor se todas as partes da árvore foram atingidas em tempo real. Isso poderia permitir que mais injeção fosse realizada para completar o preenchimento no momento ou em uma sessão futura. É de grande importância que a solução ablativa atinja todas as partes da árvore ductal para garantir que todas as células epiteliais possam ser acessadas para matar (Figura 3). Deixar para trás células epiteliais vivas dentro da árvore permitiria a possibilidade de que o câncer de mama ainda pudesse surgir. Utilizar o contraste nas injeções de ID para o sucesso da imagem da injeção também pode ser útil para outras formulações. A Tabela 1 fornece solução de problemas e dicas úteis. Outros estudos descreveram protocolos de entrega de ID para partículas virais (por exemplo, AdCre, guia CRISPR RNAs), hormônios, compostos citotóxicos, siRNAs e/ou agentes de mira em camundongos3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 38, ratos24,32,39,40,41 e coelhos42,43,44,45,46,47. Estudos clínicos independentes relataram cannulação bem sucedida de até oito dutos por mama para parto local de quimioterapia40,48,49. Visualizar o preenchimento completo ao entregar outras soluções voltadas para a prevenção ou voltadas para o tratamento valeria a pena por razões semelhantes. O conhecimento de que a solução atingiu todos os ramos e extremidades terminais da árvore será informativo na avaliação bem sucedida de prevenção ou tratamento.
Não estamos cientes de nenhum outro método de imagem intradutal em camundongos33,34 ou outros modelos animais47 que oferecem a alta resolução de nanopartículas TaOx. Note-se que o TaOx na árvore ductal murina supera os agentes de contraste aprovados pela FDA para a ductografia diagnóstica3,16. À medida que continuamos a avaliar o procedimento ablativo de IDENTIDADE para sua capacidade de prevenir o câncer de mama, poderemos determinar com mais precisão de quais glândulas o câncer surge com a ajuda de dados adicionais fornecidos através de imagens após o parto de 3. Por exemplo, pode-se determinar se uma glândula que foi apenas parcialmente preenchida é mais provável do que uma glândula não injetada para resultar na formação de tumores, que aborda o perfil de segurança e a preocupação de injeções mal sucedidas em uma mulher de alto risco. Essa técnica tem algumas limitações. Esta é uma técnica de rato relativamente desafiadora que requer destreza e proficiência do operador para manipular e cannular com sucesso cada duto. Cada injeção individual é um evento independente, portanto, a injeção mal sucedida em uma ou mais glândulas pode comprometer a interpretação do resultado. Dado o tamanho da glândula mamária murina e a fragilidade do mamilo, a fluoroscopia ou técnica semelhante de orientação de imagem não está disponível para informar em tempo real quando parar a infusão. Essa orientação de imagem em tempo real será um requisito para a implementação clínica da entrega local de uma solução ablativa.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado, em parte, pelo Instituto Nacional de Câncer R21 CA226579 e R01 CA258314 doações ao LFS e pelo Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia R01 EB029418 para a EMS. Gostaríamos de agradecer ao Instituto MSU de Ciência da Saúde Quantitativa (IQ) e instalação do Núcleo de Imagem de Engenharia pelo uso de seus sistemas de imagem e conhecimento técnico. Gostaríamos de agradecer à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Britt, K. L., Cuzick, J., Phillips, K. A. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 417-436 (2020).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal Gastroenterol. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal Gastroenterol. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the Breast Treated with Percutaneous Ethanol Injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutics Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50692 (2013).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Transactions of Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Res Treat. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Arora, R., et al. Insights from imaging the implanting embryo and the uterine environment in three dimensions. Development. 143 (24), 4749-4754 (2016).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Science Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast- A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 903-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translation Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. The Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. The Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. Biochemistry Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal Visualized Experiments: JoVE. (121), e55209 (2017).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Prevention Research (Philadelphia). 6 (1), 51-58 (2013).
