العزل والتحليل الوظيفي للبطانة الشريانية لحمة دماغ الفأر
Summary
يتم توضيح التحضير المكثف ل “أنابيب” البطانية الدماغية للفئران السليمة من الشرايين المتنية الدماغية لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي. علاوة على ذلك ، نوضح نقاط القوة التجريبية لنموذج الدراسة البطانية هذا للتصوير الفلوري وقياس الفيزيولوجيا الكهربية لمسارات الإشارات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك التغيرات في داخل الخلايا [Ca2+] وإمكانات الغشاء.
Abstract
يتم نقل تدفق الدم الدماغي عن طريق الشرايين المقاومة للأوعية الدموية والشرايين المتنية في المصب. تزداد مقاومة الأوعية الدموية الثابتة لتدفق الدم مع انخفاض القطر من الشرايين إلى الشرايين التي تغذي الشعيرات الدموية في نهاية المطاف. نظرا لصغر حجمها وموقعها في الحمة ، فقد لم تتم دراسة الشرايين بشكل كاف نسبيا ومع قابلية أقل للتكرار في النتائج من الشرايين البينية السطحية. وبغض النظر عن ذلك، فإن بنية الخلايا البطانية الشريانية ووظيفتها – وهي جزء لا يتجزأ من فسيولوجيا ومسببات الأمراض التنكسية المزمنة – تتطلب تحقيقا مكثفا. على وجه الخصوص ، تظهر الأدلة الناشئة أن الوظيفة البطانية المعرضة للخطر تسبق وتفاقم الضعف المعرفي والخرف.
في دوران الأوعية الدقيقة المتني ، تعد وظيفة قناة K + البطانية أقوى حافز للتحكم بدقة في انتشار توسع الأوعية لتعزيز الزيادات في تدفق الدم إلى مناطق النشاط العصبي. توضح هذه الورقة طريقة مكررة لعزل “الأنابيب” البطانية السليمة والمقترنة كهربائيا (قطرها ، ~ 25 ميكرومتر) من الشرايين المتنية في دماغ الفأر. يتم تأمين الأنابيب البطانية الشريانية خلال الظروف الفسيولوجية (37 درجة مئوية ، درجة الحموضة 7.4) لحل المتغيرات التجريبية التي تشمل وظيفة قناة K + وتنظيمها ، بما في ذلك ديناميكيات Ca2 + داخل الخلايا ، والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وتنظيم الدهون الغشائية. الميزة التقنية المميزة مقابل البطانة الشريانية هي الدقة المورفولوجية المعززة لأبعاد الخلايا والعضيات (مثل الميتوكوندريا) ، مما يوسع فائدة هذه التقنية. ينطوي التروية الدماغية الصحية طوال الحياة على وظيفة بطانية قوية في الشرايين المتنية ، مما يربط مباشرة تدفق الدم بتغذية النشاط العصبي والدبقي في جميع أنحاء المناطق التشريحية الدقيقة من الدماغ. وبالتالي ، من المتوقع أن تقدم هذه الطريقة بشكل كبير المعرفة العامة لفسيولوجيا الأوعية الدموية وعلم الأعصاب فيما يتعلق بالدماغ السليم والمريض.
Introduction
توفر الشرايين المتنية مباشرة الأكسجين والمواد المغذية الأساسية في جميع أنحاء الدماغ1. أثناء التفاعل مع الشعيرات الدموية ، تستجيب الشرايين عالية النشاط للأوعية الدموية للإشارات الرجعية التي تبدأها قنوات الأيونات الشعرية التي تستشعر إشارات التمثيل الغذائي من مناطق عصبية محددة2. مع تلقي حمة الدماغ تاريخيا الجزء الأكبر من التحقيق ، ظهر الآن دور للخلل الوظيفي البطاني لتوضيح الآليات المرضية المرتبطة بمختلف الاضطرابات الدماغية الوعائية التي تكمن وراء الخرف (على سبيل المثال ، السكتة الدماغية الإقفارية ، مرض الزهايمر)3،4،5،6 . البطانة هي جزء لا يتجزأ من تروية الدماغ وفقا لعدم تجانس علم الوراثة والبنية والوظيفة في جميع أنحاء قطاعات الأوعية الدموية7. تمت دراسة شرايين Pial على نطاق واسع بسبب حجمها الكبير نسبيا ، ومقاومة الأوعية الدموية القطاعية العالية ، ودورها في توزيع تدفق الدم إلى الدماغ الأساسي 8,9. وبالتالي ، من المرجح أن يؤدي الفهم الأفضل للآليات البطانية الشريانية إلى تعزيز فهم تنظيم تدفق الدم في الدماغ في الصحة والمرض نحو تطوير أنظمة علاجية جديدة.
تسلط الأدلة الناشئة الضوء على أهمية دراسة الشرايين المتنية فيما يتعلق بمسارات الإشارات المختلفة والأمراض 8,10. ومع ذلك ، فقد اقتصر هذا النهج على استخدام الشرايين المضغوطة11 السليمة و / أو مستحضرات الشرايين الشعرية المتنية (CaPA)12. لم يتم فحص الخلايا البطانية الشريانية الدماغية الأصلية المعزولة حديثا والخالية من أنواع الخلايا الأخرى والعوامل المربكة ، على الأرجح بسبب الصعوبات التقنية في عزلها. تقدم هذه الورقة تقنية سابقة تسلط الضوء على عزل البطانة الشريانية13 حتى الآن بشكل موثوق ومتكرر عزل بطانة الشرايين المتنية في الدماغ (العرض: ~ 25 ميكرومتر ، الطول: ~ 250 ميكرومتر). تساعد هذه التقنية على تحقيق الدقة المثلى للخلايا المقترنة كهربائيا وكيميائيا في اتجاهها الفردي وشبكاتها الخلوية.
وشملت المسارات الرئيسية المثيرة للاهتمام تفاعل إشارات Ca 2+ داخل الخلايا ([Ca2+]i) وفرط استقطاب إمكانات الغشاء (Vm)14,15 – وهو جزء لا يتجزأ من توسع الأوعية 16 – للسماح للدم بدخول الشعيرات الدموية وتوصيل الأكسجين والمواد المغذية إلى الحمة النشطة 17. تسمح هذه المستحضرات بتسجيلات كهروفسيولوجية في الوقت الفعلي للقنوات الأيونية ، بما في ذلك Ca2 + ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) وقنوات K + و / أو التصوير الفلوري للعضيات داخل الخلايا داخل أنابيب الخلايا البطانية في ظروف شبه فسيولوجية. هذه تقنية مناسبة للباحثين المهتمين بالآليات الخلوية الفسيولوجية التي تحكم تحكم تحكم الخلايا البطانية في توصيل تدفق الدم الدماغي إلى حمة الدماغ. وإجمالا، ستساعد هذه التقنية الباحثين على فهم مسارات الإشارات البطانية الأساسية والتواصل الشبكي للشرايين المضمنة في حمة الدماغ بشكل أفضل أثناء معالجة الأسئلة المتعلقة بفسيولوجيا الأوعية الدموية الدماغية وعلم الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الأمراض الدماغية الوعائية (CVD) والشيخوخة ومرض الزهايمر مرتبطة ارتباطا وثيقا وهي موضوع حالي لأبحاث الخرف4،8،14،21. وبالتالي ، من الواضح أن دراسات الشبكة الدماغية الوعائية سيكون لها تأثير واسع …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R00AG047198 & R56AG062169 إلى EJB; R00HL140106 إلى PWP) وجمعية الزهايمر (AZRGD-21-805835 إلى PWP). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو جمعية الزهايمر.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer’s disease: Is Alzheimer’s a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer’s disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
- Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
- Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer’s disease. Function. 2 (2), (2021).
- Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
- Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
- Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
- Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
- Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
- Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer’s disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
- Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
- Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer’s disease–lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
- Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
- Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
- Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).
