Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus
Summary
Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer “Röhrchen” der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.
Abstract
Der zerebrale Blutfluss wird durch vaskuläre Widerstandsarterien und nachgeschaltete parenchymale Arteriolen gefördert. Der stationäre Gefäßwiderstand gegen den Blutfluss nimmt mit abnehmendem Durchmesser von den Arterien zu den Arteriolen zu, die letztendlich in die Kapillaren münden. Aufgrund ihrer geringeren Größe und Lage im Parenchym wurden Arteriolen relativ wenig untersucht und mit geringerer Reproduzierbarkeit der Befunde als oberflächliche Piialarterien. Unabhängig davon erfordert die Struktur und Funktion der arteriolaren Endothelzellen – integraler Bestandteil der Physiologie und Ätiologie chronischer degenerativer Erkrankungen – umfangreiche Untersuchungen. Insbesondere zeigen neue Erkenntnisse, dass eine beeinträchtigte Endothelfunktion kognitiven Beeinträchtigungen und Demenz vorausgeht und diese verschlimmert.
In der parenchymalen Mikrozirkulation ist die endotheliale K + – Kanalfunktion der robusteste Reiz, um die Ausbreitung der Vasodilatation fein zu kontrollieren, um die Erhöhung des Blutflusses in Bereiche der neuronalen Aktivität zu fördern. Diese Arbeit veranschaulicht eine verfeinerte Methode zur frischen Isolierung intakter und elektrisch gekoppelter endothelialer “Röhren” (Durchmesser, ~ 25 μm) aus parenchymalen Arteriolen des Mausgehirns. Arterioläre Endothelröhren werden unter physiologischen Bedingungen (37 °C, pH 7,4) gesichert, um experimentelle Variablen aufzulösen, die die K+– Kanalfunktion und deren Regulation umfassen, einschließlich intrazellulärer Ca2+- Dynamik, Veränderungen des Membranpotentials und Membranlipidregulation. Ein deutlicher technischer Vorteil gegenüber dem arteriellen Endothel ist die verbesserte morphologische Auflösung der Zell- und Organellendimensionen (z. B. Mitochondrien), was die Nützlichkeit dieser Technik erweitert. Eine gesunde zerebrale Perfusion während des gesamten Lebens beinhaltet eine robuste Endothelfunktion in parenchymalen Arteriolen, die den Blutfluss direkt mit der Förderung der neuronalen und glialen Aktivität in präzisen anatomischen Regionen des Gehirns verbindet. Es wird daher erwartet, dass diese Methode das allgemeine Wissen über Gefäßphysiologie und Neurowissenschaften in Bezug auf das gesunde und kranke Gehirn erheblich voranbringen wird.
Introduction
Parenchymale Arteriolen liefern direkt essentiellen Sauerstoff und Nährstoffe im gesamten Gehirn1. Während der Verbindung mit Kapillaren reagieren hochvasoaktive Arteriolen auf retrograde Signale, die von Kapillarionenkanälen initiiert werden, die Stoffwechselsignale aus bestimmten neuronalen Regionen wahrnehmen2. Da das Gehirnparenchym in der Vergangenheit den Großteil der Untersuchungen erhalten hat, hat sich nun eine Rolle für die endotheliale Dysfunktion für die Klärung pathologischer Mechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen zerebrovaskulären Erkrankungen ergeben, die Demenz zugrunde liegen (z. B. ischämischer Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit)3,4,5,6 . Das Endothel ist ein integraler Bestandteil der Perfusion des Gehirns in Übereinstimmung mit der Heterogenität von Genetik, Struktur und Funktion in den Gefäßsegmenten7. Pialarterien wurden aufgrund ihrer relativ großen Größe, ihres hohen segmentalen Gefäßwiderstands und ihrer Rolle bei der Blutflussverteilung zum darunter liegenden Großhirnumfassend untersucht 8,9. Daher wird ein besseres Verständnis der arteriolaren Endothelmechanismen wahrscheinlich das Verständnis der Blutflussregulation des Gehirns in Gesundheit und Krankheit im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Regime verbessern.
Neue Erkenntnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, parenchymale Arteriolen in Bezug auf verschiedene Signalwege und Krankheiten zu untersuchen 8,10. Dieser Ansatz beschränkte sich jedoch auf die Verwendung intakter druckbeaufschlagter Arteriolen-11- und/oder Kapillar-Parenchymal-Arteriolen-Präparate (CaPA)12. Frisch isolierte, native zerebrale arterioläre Endothelzellen, die frei von anderen Zelltypen und Störfaktoren sind, wurden nicht untersucht, wahrscheinlich aufgrund technischer Schwierigkeiten bei ihrer Isolierung. Diese Arbeit bringt eine frühere Technik voran, die die Isolierung des arteriellen Endothels13 hervorhebt, um nun das Endothel der parenchymalen Arteriolen des Gehirns zuverlässig und reproduzierbar zu isolieren (Breite: ~ 25 μm, Länge: ~ 250 μm). Diese Technik hilft, eine optimale Auflösung von elektrisch und chemisch gekoppelten Zellen in ihrer individuellen Orientierung und ihren zellulären Netzwerken zu erreichen.
Zu den wichtigsten interessanten Signalwegen gehörten die Wechselwirkung der intrazellulären Ca 2 + ([Ca2 +]i) -Signalgebung und die Hyperpolarisation des Membranpotentials (Vm) 14,15 – integraler Bestandteil der Vasodilatation 16 –, damit Blut in die Kapillaren eindringen und Sauerstoff und Nährstoffe an aktives Parenchym 17 abgebenkann. Diese Präparate ermöglichen elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnungen von Ionenkanälen, einschließlich Ca2 +-permeant, transientem Rezeptorpotential (TRP) und K + –Kanälen und/oder fluoreszierender Bildgebung von intrazellulären Organellen in Endothelzellröhren unter nahezu physiologischen Bedingungen. Dies ist eine geeignete Technik für Forscher, die sich für physiologische zelluläre Mechanismen interessieren, die die Endothelzellkontrolle der zerebralen Blutflusslieferung an das Gehirnparenchym steuern. Insgesamt wird diese Technik den Forschern helfen, grundlegende endotheliale Signalwege und die Netzwerkkommunikation von Arteriolen, die in das Parenchym des Gehirns eingebettet sind, besser zu verstehen und gleichzeitig Fragen im Zusammenhang mit der zerebrovaskulären Physiologie und Pathologie zu beantworten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass zerebrovaskuläre Erkrankungen (CVD), Altern und Alzheimer-Krankheit stark korreliert sind und ein aktuelles Thema der Demenzforschungsind 4,8,14,21. Daher ist es offensichtlich, dass Studien des zerebrovaskulären Netzwerks einen breiten Einfluss auf die Gesundheit haben würden, während sie eine fortgesetzte umfassende Untersuchung während der Kran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 an EJB; R00HL140106 bis PWP) und der Alzheimer’s Association (AZRGD-21-805835 bis PWP). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder der Alzheimer’s Association dar.
Materials
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Audible baseline monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Bath Chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Borosilicate glass capillaries (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| BSA: Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: Calcium Chloride | Sigma | 223506 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Cover Glass (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Data Acquision Digitizer | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom) | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Elastase (porcine pancreas) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Forceps (Fine-tipped, sharpened) | FST | Dumont #5 & Dumont #55 | |
| Function Generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| HCl: Hydrochloric Acid | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma | H4034 | |
| Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Micropipette puller (digital) | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Microscope (Nikon-inverted) | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor) | |
| Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Microscope Stage (Aluminum) | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt | Tocris | 1624 | |
| NaCl: Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| NaOH: Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Scissors (3 mm & 7 mm blades) | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Syringe filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Temperature Controller (Dual Channel) | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Valve Control System | Warner Instruments | VC-6 | |
| Vibration Isolation Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g |
References
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