Здесь представлен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием простого, хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который может быть легко реализован в большинстве лабораторий.
Железо является важным микроэлементом. Как перегрузка железом, так и его дефицит очень вредны для человека, а уровень железа в тканях точно регулируется. Использование экспериментальных животных моделей перегрузки или дефицита железа сыграло важную роль в углублении знаний о механизмах, участвующих в системной и клеточной регуляции гомеостаза железа. Измерение общего уровня железа в тканях животных обычно выполняется с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии или колориметрического анализа, основанного на реакции негемового железа с батофенантроловым реагентом. В течение многих лет колориметрический анализ использовался для измерения содержания негемового железа в широком диапазоне тканей животных. В отличие от атомно-абсорбционной спектроскопии, она исключает вклад гемового железа, полученного из гемоглобина, содержащегося в эритроцитах. Кроме того, он не требует сложных аналитических навыков или дорогостоящего оборудования и, таким образом, может быть легко реализован в большинстве лабораторий. Наконец, колориметрический анализ может быть либо на основе кюветы, либо адаптирован к формату микропластины, что обеспечивает более высокую пропускную способность образца. Настоящая работа обеспечивает хорошо зарекомендовавший себя протокол, который подходит для обнаружения изменений в уровнях железа в тканях в различных экспериментальных моделях перегрузки железа или дефицита железа на животных.
Железо является важным микроэлементом, необходимым для функции белков, участвующих в важнейших биологических процессах, таких как транспорт кислорода, производство энергии или синтез ДНК. Важно отметить, что как избыток железа, так и дефицит железа наносят большой ущерб здоровью человека, а уровни железа в тканях точно регулируются. Аномальное усвоение железа с пищей, диеты с дефицитом железа, повторные переливания крови и хроническое воспаление являются распространенными причинами связанных с железом расстройств, которые затрагивают миллиарды людей во всем мире1,2,3.
Экспериментальные животные модели перегрузки или дефицита железа сыграли важную роль в продвижении наших знаний о механизмах, участвующих в системной и клеточной регуляции гомеостаза железа4. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый за последние два десятилетия, многие ключевые аспекты остаются недостижимыми. В ближайшие годы точное измерение общего уровня железа в тканях животных останется важным шагом для продвижения исследований в области биологии железа.
Большинство лабораторий количественно оценивают тканевое железо с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС), масс-спектрометрии плазмы с индуктивной связью (ICP-MS) или колориметрического анализа, основанного на реакции негемового железа с батофенантролиновым реагентом. Последний основан на оригинальном методе, описанном Торрансом и Ботвеллом более 50 лет назад5,6. В то время как вариация этого метода была впоследствии разработана с использованием феррозина в качестве альтернативы батофенантролину7, последний остается наиболее широко цитируемым хромогенным реагентом в литературе.
Выбор метода часто зависит от имеющихся знаний и инфраструктуры. В то время как ААС и ВЧП-МС более чувствительны, колориметрический анализ остается широко используемым, поскольку он представляет следующие важные преимущества: i) он исключает вклад гемового железа, полученного из гемоглобина, содержащегося в эритроцитах; ii) не требует сложных аналитических навыков или дорогостоящего оборудования; и iii) оригинальный анализ на основе кюветы может быть адаптирован к формату микропластины, что обеспечивает более высокую пропускную способность образца. Колориметрический подход, представленный в этой работе, обычно используется для количественной оценки изменений в тканевых негемовых уровнях железа в различных экспериментальных моделях перегрузки железа или дефицита железа на животных, от грызунов до рыб и плодовой мухи. Здесь представлен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием простого, хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который большинство лабораторий должны найти простым в реализации.
Приведен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием адаптации колориметрического анализа на основе батофенантролина, первоначально описанного Торрансом и Ботвеллом5,6. Критическими этапами метода являются сушк…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась национальными фондами через FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., в рамках проекта UIDB/04293/2020.
96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
Oven | Binder | ED115 | |
Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |