Summary
Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde colorimetrische test die gemakkelijk in de meeste laboratoria kan worden geïmplementeerd.
Abstract
IJzer is een essentiële micronutriënt. Zowel ijzerstapeling als tekort zijn zeer schadelijk voor de mens en het weefselijzergehalte wordt fijn gereguleerd. Het gebruik van experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -deficiëntie is van groot belang geweest voor het bevorderen van de kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase. De meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels wordt gewoonlijk uitgevoerd met atomaire absorptiespectroscopie of met een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantronlinereagens. Al vele jaren wordt de colorimetrische test gebruikt voor het meten van het niet-heemijzergehalte in een breed scala aan dierlijke weefsels. In tegenstelling tot atomaire absorptiespectroscopie, sluit het de bijdrage van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen uit. Bovendien vereist het geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur en kan het dus gemakkelijk in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd. Ten slotte kan de colorimetrische test op cuvette-basis zijn of worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. Het huidige werk biedt een goed ingeburgerd protocol dat geschikt is voor de detectie van veranderingen in weefselijzerniveaus in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort.
Introduction
IJzer is een essentiële micronutriënt, die nodig is voor de functie van eiwitten die betrokken zijn bij cruciale biologische processen zoals zuurstoftransport, energieproductie of DNA-synthese. Belangrijk is dat zowel ijzeroverschot als ijzertekort zeer schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid en dat weefselijzerniveaus nauwkeurig worden gereguleerd. Abnormale ijzerabsorptie via de voeding, ijzertekort, herhaalde bloedtransfusies en chronische ontsteking zijn veel voorkomende oorzaken van ijzergerelateerde aandoeningen die miljarden mensen wereldwijd treffen1,2,3.
Experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -tekort zijn instrumenteel geweest om onze kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase4 te bevorderen. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang die de afgelopen twee decennia is geboekt, blijven veel belangrijke aspecten ongrijpbaar. In de komende jaren zal de nauwkeurige meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels een cruciale stap blijven om het onderzoek op het gebied van ijzerbiologie te bevorderen.
De meeste laboratoria kwantificeren weefselijzer met atomaire absorptiespectroscopie (AAS), inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS), of een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantrontrolinereagens. Dit laatste is gebaseerd op de oorspronkelijke methode beschreven door Torrance en Bothwell meer dan 50 jaar geleden5,6. Hoewel vervolgens een variant van deze methode werd ontwikkeld met ferrozine als alternatief voor bathofenanthroline7, blijft dit laatste het meest geciteerde chromogene reagens in de literatuur.
De gekozen methode is vaak afhankelijk van de beschikbare expertise en infrastructuur. Hoewel AAS en ICP-MS gevoeliger zijn, blijft de colorimetrische test veel gebruikt omdat het de volgende belangrijke voordelen biedt: i) het sluit de bijdrage uit van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen; ii) het vereist geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur; en iii) de oorspronkelijke test op basis van cuvette kan worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. De colorimetrische benadering die in dit werk wordt gepresenteerd, wordt routinematig gebruikt om veranderingen in weefsel niet-heemijzerniveaus te kwantificeren in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort, van knaagdieren tot vissen en fruitvlieg. Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde, colorimetrische test die de meeste laboratoria gemakkelijk te implementeren zouden moeten vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 muizen werden commercieel aangekocht en hepcidine-null (Hamp1−/−) muizen op een C57BL/6 achtergrond8 waren een vriendelijk geschenk van Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankrijk). Dieren werden gehuisvest in de i3S-dierenfaciliteit onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden, in een temperatuur- en lichtgecontroleerde omgeving, met vrije toegang tot standaard knaagdier chow en water. Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax) werd gekocht van een commerciële viskwekerij en gehuisvest in de ICBAS-dierenfaciliteit, in een temperatuur- en lichtgecontroleerde omgeving, en dagelijks ad libitum gevoed met standaard zeebaarsvoer. Alle procedures met gewervelde dieren zijn goedgekeurd door de i3S Animal Ethics Committee en de nationale autoriteit, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informatie over commerciële reagentia, apparatuur en dieren wordt vermeld in de tabel met materialen.
1. Oplossingsvoorbereiding
OPMERKING: Hanteer en bereid alle reagentia en oplossingen voor met ijzervrij glaswerk of plastic wegwerpartikelen. Sta niet toe dat metalen laboratoriummaterialen (bijv. roestvrijstalen spatels) in contact komen met een reagens of oplossing, vanwege het risico op ijzerverontreiniging. Zorg ervoor dat herbruikbaar glaswerk ijzervrij is. Was de materialen gedurende 30-60 minuten met het juiste laboratoriummiddel, spoel met gedeïoniseerd water, week een nacht in een 37% salpeterzuuroplossing verdund 1:3 met gedeïoniseerd water, spoel opnieuw met gedeïoniseerd water en laat drogen.
- Zuurmengsel: Voeg 10 g trichloorazijnzuur toe aan 82,2 ml 37% zoutzuur in een glazen fles, los grondig op en stel het uiteindelijke volume in op 100 ml met gedeïoniseerd water. Schud voor gebruik. Als alternatief, gebruik slechts 37% zoutzuur voor weefselvertering.
OPMERKING: De oplossing is ten minste 2 maanden stabiel wanneer deze wordt bewaard in donkerbruine glazen reagensflessen.
LET OP: Zoutzuur en trichloorazijnzuur zijn corrosief en geconcentreerde vormen geven giftige zure dampen af. Draag te allen tijde beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van zuren. Vermijd het inademen ervan en hanteer altijd zuren onder een zuurkap. - Verzadigd natriumacetaat: Voeg 228 g watervrij natriumacetaat toe aan 400 ml gedeïoniseerd water in een glazen fles en roer 's nachts bij kamertemperatuur. Laat de oplossing rusten en een dag neerslaan. Als er geen neerslag optreedt, blijf dan kleine hoeveelheden natriumacetaat toevoegen. Bewaar de oplossing in een glazen fles.
- Chromogeenreagens: Voeg voor de bereiding van 1 ml chromogeenreagens 1 mg 4,7-difenyl-1,10-fenanthroline disulfonzuur dinatriumzout toe aan 500 μL gedeïoniseerd water en 10 μL geconcentreerd (100%) thioglycolzuur en los grondig op. Vul het uiteindelijke volume aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Bereid zoveel chromogeenreagens als nodig is. De oplossing is 1 maand stabiel wanneer deze wordt beschermd tegen licht. - Werkend chromogeenreagens (WCR): Voeg 1 volume van het chromogeenreagens toe aan 5 volumes verzadigd natriumacetaat en 5 volumes gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. - Standaardoplossing voor voorraadijzer: Om een 20 mM stockijzeroplossing te bereiden, plaatst u 111,5 mg carbonylijzerpoeder in een maatkolf van 250 ml met 5.480 μL 37% zoutzuur. Laat een nacht oplossen bij kamertemperatuur (of incubeer in een kokend waterbad). Maak vervolgens de oplossing aan tot een eindvolume van 100 ml met gedeïoniseerd water.
OPMERKING: De standaardoplossing kan voor onbepaalde tijd worden bewaard wanneer deze wordt opgeslagen in een goed afgesloten vat. - Working Iron Standard Solution (WISS): Voeg 13,5 μL 37% zoutzuur toe aan 500 μL gedeïoniseerd water. Voeg 10 μL van de Stock Iron Standard Solution toe en vul het uiteindelijke volume aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; gemeten met AAS).
OPMERKING: De werkoplossing moet op de dag van gebruik vers worden bereid.
2. Drogen van monsters
- Snijd een weefselmonster van 10-100 mg met een scalpelmesje. Weeg het nauwkeurig in een analytische/precisiebalans over een klein stukje parafilm (Fresh Weight).
- Plaats het stukje weefsel met behulp van een plastic pincet in een 24-wells plaat (ongelidd om waterverdamping mogelijk te maken) en laat het drogen op een standaard incubator bij 65 °C gedurende 48 uur.
- U kunt ook een magnetronvergistingsoven in het laboratorium gebruiken voor het drogen van weefselmonsters. Plaats met een plastic pincet het gewogen stuk tissue in een ijzervrije teflonbeker en droog het in de magnetron. Stel de bedrijfsparameters in volgens de handleiding van het instrument.
OPMERKING: Als referentie worden de bedrijfsparameters voor het drogen van levermonsters met behulp van de specifieke digestieoven (zie Tabel met materialen) weergegeven in tabel 1. - Plaats met behulp van een plastic pincet elk gedroogd stukje weefsel over een klein stukje parafilm in een analytische / precisiebalans en weeg het nauwkeurig (Drooggewicht).
3. Monster zure spijsvertering
- Breng met behulp van een plastic pincet elk gedroogd stuk weefsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 1 ml van het zuurmengsel toe en sluit de microcentrifugebuis. Bereid een zuur blanco op dezelfde manier, behalve dat het weefsel wordt weggelaten.
LET OP: Het zuurmengsel is corrosief en geeft giftige dampen af. Draag beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van het zuurmengsel. Vermijd het inademen en behandel het altijd onder een zuurkast. - Verteer de weefsels door de microcentrifugebuizen gedurende 20 uur in een incubator bij 65 °C te incuberen.
- Breng na afkoeling tot kamertemperatuur 500 μL van het heldere (gele) zuurextract (supernatant) over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een micropipette met plastic uiteinden. Als het niet mogelijk is om een duidelijk supernatant te verkrijgen, voer dan een korte centrifugatiespin uit.
LET OP: Het bovennatuurlijk is zeer zuur. Draag beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van de supernatanten. Hanteer ze altijd onder een zuurkast.
OPMERKING: Op dit punt kunnen de zure extracten onmiddellijk worden gebruikt voor de colorimetrische test of worden ingevroren bij -20 °C voor later gebruik. Ontdooi bevroren monsters volledig tot kamertemperatuur en vortex ze voor gebruik.
4. Kleurontwikkeling
- Bereid chromogeenreacties zoals aangegeven in tabel 2 in microcentrifugebuizen van 1,5 ml of, voor een hogere doorvoer, rechtstreeks in de vlakke bodem, heldere, onbehandelde polystyreenmicroplaten met 96 putten. Bereid alle reacties (zuur blanco, standaard en monster) ten minste in tweevoud voor.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
5. Absorptiemeting
- Meet de absorptie van monsters in een spectrofotometer of plaatlezer bij een golflengte van 535 nm tegen een gedeïoniseerde waterreferentie. Platen kunnen ongelidd of afgedekt worden gelezen. Verwijder in de dekselbehuizing eventuele condensatie die ontstaat als gevolg van het vrijkomen van zure dampen uit het deksel vlak voor de meting om mogelijke interferentie met de absorptiemeting te voorkomen.
OPMERKING: De optische absorptie van de zuur blanco afgelezen tegen gedeïoniseerd water (referentie) moet minder dan 0,015 zijn; de optische absorptie van de standaard en de monsters moet tussen 0,100 en 1,000 liggen. Voor monsters met een zeer hoog of zeer laag ijzergehalte moeten de volumes zuurextract (supernatant) en diH2O mogelijk worden aangepast (tabel 2): als de absorptie groter is dan 1,0, gebruik dan een kleiner monstervolume (supernatant); wanneer de absorptie lager is dan 0,1, gebruik dan een hoger volume van het supernatant. Het monstervolume (Vsmp) wordt in aanmerking genomen bij de berekening van het weefselijzergehalte van elk monster (zie stap 6).
6. Berekening van het weefselijzergehalte
- Bereken het ijzergehalte van niet-heemweefsel met de volgende vergelijking:
Weefselijzer (μg/g droog weefsel) =
AT = absorptie van het testmonster
AB = absorptie van zuur blank
AS = absorptie van standaard
Fes = ijzerconcentratie van WISS (μg Fe/ml)
W = gewicht van de droge stof (g)
Vsmp = monstervolume (variabel volume supernatant in tabel 2 omgerekend naar ml)
Vf = eindvolume van het zuurmengsel na incubatie gedurende de nacht bij 65 °C (overeenkomend met het zuurvolume plus het volume droge stof in ml; als de monstergewichten niet significant verschillen, ga dan uit van een constant volume ≈ 1 ml)
Vstd = ijzerstandaardvolume (volume WISS in tabel 2 omgerekend naar ml)
Vrv = eindreactievolume (totaal volume in tabel 2 omgerekend naar ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cuvette versus 96-well microplate vergelijking
De meting van weefsel niet-heemijzer door reactie met een bathofenantronline-reagens dat oorspronkelijk door Torrance en Bothwell is beschreven5,6 is gebaseerd op het gebruik van een spectrofotometer voor absorptiemeting. Daarom zijn de volumes die worden gebruikt in de chromogeenreactie compatibel met de grootte van een gewone spectrofotometer cuvette. Het huidige werk beschrijft een methodeaanpassing waarbij de chromogeenreacties direct in een 96-well microplaat worden bereid voor absorptiemeting in een microplaatlezer, waardoor kleinere reagensvolumes nodig zijn en een hogere doorvoer mogelijk is.
Om de gevoeligheid van beide benaderingen te vergelijken, werd aanvankelijk een seriële verdunning van de werkijzerstandaardoplossing (WISS) voorbereid en werden de chromogeenreacties geassembleerd in buizen van 1,5 ml of in platen met 96 putten, zoals aangegeven in tabel 2. De absorptie werd gemeten in respectievelijk een spectrofotometer (met cuvette) of in een microplaatlezer. Representatieve standaardcurven gegenereerd met de twee benaderingen zijn weergegeven in figuur 1A. In beide gevallen was de lineariteit zeer hoog (r2 = 0,9996 en r2 = 0,9997 voor respectievelijk microplaat en cuvet) over de geteste ijzerconcentraties.
Opmerkelijk is dat een WISS met 11.169 μg Fe / ml werd gebruikt. Uit de huidige gegevens blijkt dat lagere ijzerconcentraties kunnen worden gebruikt om de norm voor te bereiden. Het gebruik van een WISS met hogere ijzerconcentraties wordt echter niet aanbevolen, omdat dit kan leiden tot absorptiewaarden die het lineaire dynamische detectiebereik van de spectrofotometer overschrijden, waardoor standaardcurven plateau worden.
Om de cuvette- en microplaatgebaseerde testen verder te vergelijken, werd het niet-heemijzergehalte gemeten in in totaal 55 muisweefselmonsters (lever, milt, hart, long, beenmerg). Er werd een zeer hoge mate van correlatie waargenomen tussen de twee methodologieën (r = 0,999, p < 0,0001), wat aangeeft dat de op microplaten gebaseerde methode een geldig alternatief is voor de oorspronkelijke cuvette-gebaseerde methode (figuur 1B).
Ten slotte werden niet-heemijzergehalten in muizenweefsels gekwantificeerd met de op microplaten gebaseerde methode na zure vertering van monsters afkomstig van dezelfde weefsels met ofwel een mengsel van zoutzuur en trichloorazijnzuur (volgens de oorspronkelijke beschrijving van de methode) of zoutzuur alleen. Er werd een zeer hoge correlatie waargenomen (r = 0,999, p < 0,0001, figuur 1C), waaruit blijkt dat trichloorazijnzuur kan worden weggelaten uit de zure vertering.
De hieronder opgenomen representatieve resultaten werden verkregen door de absorptie van het monster in 96-putplaten te meten.
Meting van weefsel niet-heemijzergehalte in een muismodel van genetische hemochromatose
Met behulp van de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische assay werd het niet-heemijzergehalte bepaald in verschillende weefsels (lever, milt, hart en pancreas) van de veelgebruikte muizenstam C57BL / 6 en van hepcidine knock-out (Hamp1-/-) muizen (in een C57BL / 6 genetische achtergrond). Representatieve ijzergehaltes zijn weergegeven in figuur 2. Hepcidine is een belangrijke regulator van het ijzermetabolisme en de verstoring ervan leidt tot een hemochromatose-achtig ijzerafzettingsfenotype, met ernstige hepatische, pancreas- en cardiale ijzeraccumulatie en miltijzerdepletie8.
Meting van het niet-heemijzergehalte in zeebaarslever na experimentele ijzermodulatie
Met behulp van de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische assay werden niet-heemijzergehalten bepaald in de lever van gezonde (controle), met ijzer behandelde (2 mg ijzerdextran toegediend via de intraperitoneale route) en anemische (2% v / w bloed getrokken uit de caudale vaten) Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax). Zoals verwacht nam het ijzergehalte in de lever enorm toe bij met ijzer behandelde dieren, terwijl bloedarmoede een lichte vermindering van de leverijzervoorraden veroorzaakte (figuur 3).
Meting van het gehalte aan niet-heemijzer in heel Drosophila melanogaster
Hoewel de huidige methode niet geschikt is om niet-heemijzergehaltes in individuele Drosophila-vliegen te meten vanwege hun kleine lichaamsmassa (gemiddeld gewicht is respectievelijk 0,6 mg en 0,8 mg voor mannen en vrouwen)9, kan het met succes worden gebruikt met gepoolde vliegen. Figuur 4 toont representatieve niet-heemijzergehaltes voor groepen van 20 hele mannelijke vliegen, ofwel wild-type Oregon-R of Malvolio (Mvl) knock-out. Mvl is de homoloog van het SLC11A2-gen van zoogdieren, dat codeert voor een eiwit dat divalente metaaltransporter 1 (DMT1) wordt genoemd, en de genetische verstoring ervan leidt tot ijzertekort10. Zoals verwacht, vertoonden Mlv-vliegen een aanzienlijk lager niet-heemijzergehalte in vergelijking met wild-type.
| Vermogen 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Druk (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tijd (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tijd onder druk (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| WAAIER: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabel 1: Bedrijfsparameters voor leverdroging in een microgolfvergistingsoven die hier wordt gebruikt.
| WCR (μL) | Zuurmengsel (μL) | Supernatant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Totaal volume (μL) | ||
| Buizen van 1,5 ml | Zuur Blank | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Standaard | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Monster | 1000 | Veranderlijk | Veranderlijk | 1300 | |||
| 96-well microplaat | Zuur Blank | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Standaard | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Monster | 150 | Veranderlijk | Veranderlijk | 195 |
Tabel 2: Bereiding van chromogeenreacties in buizen van 1,5 ml of platen met 96 putten.
Figuur 1: Bepaling van niet-heemijzer door de colorimetrische assays op basis van cuvette of 96-well microplates. (A) standaardcurven voor microplate- (open vierkanten
) en cuvette-gebaseerde (open driehoeken Δ) assays. (B) Correlatie tussen op cuvette gebaseerde en op microplaten gebaseerde niet-heemijzerniveaus in 55 weefselmonsters van 6 maanden oude mannelijke C57BL / 6-muizen, inclusief lever (vaste cirkels
), milt (open cirkels
), hart (vaste driehoeken
), long (sterretjes
) en beenmerg (diamanten
). (C) niet-heemijzergehalten in een subset van weefsels van 6 maanden oude mannelijke muizen (lever, vaste cirkels; milt, open cirkels), gemeten met de 96-well microplaat-gebaseerde test na zure vertering van monsters met een mengsel van zoutzuur en trichloorazijnzuur (HCl + C2HCl3O2) of zoutzuur alleen (HCl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Niet-heemijzergehalte bepaald in verschillende weefsels door op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische assay. Niet-heemijzergehalte in de lever, milt, hart en alvleesklier van mannelijke C57BL / 6 wild-type muizen (open cirkels ) en mannelijke hepcidine-deficiënte Hamp1-/ - muizen op C57BL / 6 genetische achtergrond (open vierkanten ) op de leeftijd van 8 weken, gemeten met de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische assay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Hepatische niet-heemijzergehalten in juveniele vrouwelijke Europese zeebaars na experimentele ijzermodulatie. IJzerstapeling werd bereikt door intraperitoneale toediening van 2 mg ijzerdextran, terwijl bloedarmoede werd geïnduceerd door de terugtrekking van 2% v / w bloed uit de caudale vaten. Levers werden verzameld op 4 dagen na ijzerbehandeling of bloedafname. Controledieren waren gezonde, onbehandelde zeebaars. Niet-heemijzergehalten werden gemeten met de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Niet-heemijzergehalte in 1 maand oude Drosophila, gemeten met de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische test. De resultaten tonen (A) het niet-heemijzergehalte in elke pool van 20 vliegen of (B) het geschatte ijzergehalte van elke individuele vlieg, rekening houdend met een gemiddeld gewicht van 0,64 mg / vlieg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels wordt verstrekt, met behulp van een aanpassing van de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische test die oorspronkelijk werd beschreven door Torrance en Bothwell5,6. De kritische stappen van de methode zijn het drogen van weefselmonsters; eiwitdenaturatie en afgifte van anorganisch ijzer door zure hydrolyse; reductie van ijzer (Fe3 +) tot de ijzertoestand (Fe2 +) in aanwezigheid van het reductiemiddel thioglycolzuur en de reactie ervan met een bathofenantronas (chromogeenreactie); absorptiemeting van het resulterende ferro-ion / bathofenanthroline roze complex; en berekening van het weefselijzergehalte.
Het huidige werk laat zien hoe het originele cuvette-gebaseerde protocol kan worden aangepast aan een 96-well-gebaseerd formaat voor een hogere doorvoer, zonder afbreuk te doen aan de testgevoeligheid. Met name zorgt deze aanpassing voor een aanzienlijke tijdsbesparing, omdat: 1) een groter aantal chromogeenreacties tegelijkertijd kan worden bereid in 96-well platen met behulp van meerkanaals pipetten; en 2) absorptiemetingen zijn dramatisch sneller in een plaatlezer dan bij gebruik van een spectrofotometer. Een ander belangrijk voordeel van de test op basis van microplaten is de aanpassing van de chromogeenreactievolumes, waardoor de kosten met reagentia (met name met het bathofenantronlinereagens) aanzienlijk worden verlaagd. Het hele protocol kan in 4 dagen worden voltooid. Het drogen van monsters (wat tot 48 uur kan duren wanneer het wordt uitgevoerd in een oven bij 65 °C) en zure vergisting (die gemakkelijk 's nachts gedurende 20 uur wordt uitgevoerd) zijn de twee meest tijdrovende stappen. Het drogen van monsters kan worden versneld met behulp van een microgolfvergistingsoven die is ontworpen voor laboratoriumgebruik bij het verteren, oplossen, hydrolyseren of drogen van een breed scala aan materialen. Omdat het mogelijk is om de meeste weefselmonsters in minder dan 2,5 uur te drogen, kan men het hele protocol in slechts 2 dagen uitvoeren. Omdat de capaciteit van een magnetron echter beperkt is tot het aantal teflonbekers dat erin past, en omdat de bekers na elk gebruik moeten worden gewassen en ontsmet, kunnen gebruikers het handiger vinden om monsters te drogen in 24-wells platen bij 65 ° C bij het hanteren van een groot aantal monsters. De tijd die nodig is om de weefsels te drogen kan nog steeds worden verkort door temperaturen boven 65 °C te gebruiken; plastic materiaal moet echter worden vermeden vanwege het risico op smelten.
Eerder hadden Grundy et al.11 een aanpassing ontwikkeld van de methode waarbij de gehele test wordt uitgevoerd in 96-well platen, zonder een monsterdroogstap op te nemen. De meting van metalen in weefsels met nat gewicht in plaats van droog gewicht wordt echter aanzienlijk beïnvloed door de variabele hoeveelheid gewichtsverlies door luchtdroging, zowel in verse als in bevroren weefselmonsters12. Daarom wordt aanbevolen om het ijzergehalte te normaliseren tegen het droge gewicht van het weefsel. Als weefseldroging geen haalbare optie is (bijv. Vetweefsel), wordt voorgesteld dat de test onmiddellijk na monsterverzameling wordt uitgevoerd, zodat een nauwkeurige bepaling van het verse gewicht niet significant wordt beïnvloed door opslagartefacten.
Ook de samenstelling van de zure oplossing kwam aan bod. Volgens het oorspronkelijke protocol5,6 worden weefsels verteerd met een zuurmengsel bestaande uit zoutzuur en trichloorazijnzuur. Het huidige werk toont echter aan dat 37% zoutzuur alleen even efficiënt is, althans voor het verteren van lever- en miltmonsters.
De standaardoplossing voor voorraadijzer wordt bereid met carbonylijzerpoeder, een goedkoop en zeer zuiver ijzerpoeder. Volgens de hierin beschreven aanpak werd een standaardoplossing voor ijzer met 1,1169 mg Fe/ml (20 mM) bereid, zoals vervolgens bepaald door AAS. Andere bronnen van ijzer (bijv. ijzersulfaat, ijzernitrocytentilaat) of commerciële standaardoplossingen kunnen worden gebruikt om de standaardoplossing voor voorraadijzer te genereren, op voorwaarde dat de werkelijke ijzerconcentratie wordt bepaald en de lineariteit van de test wordt bevestigd door een standaardcurve uit te voeren.
Met behulp van de huidige methode werd het niet-heemijzergehalte van een verscheidenheid aan dierlijke weefsels met succes gemeten. Representatieve resultaten verkregen met knaagdierweefsels (lever, milt, hart en pancreas), zeebaarslever en hele drosophila zijn inbegrepen. De methode vereist geen geavanceerde analytische hulpmiddelen of dure infrastructuur en kan dus gemakkelijk in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd. Samenvattend kan de hierin beschreven methode op grote schaal worden toegepast in studies van ijzerhomeostase en ijzergerelateerde aandoeningen met behulp van experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -tekort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door nationale fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., in het kader van het project UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
