Mätning av vävnadsinnehåll utan heme järn med hjälp av en Bathophenanthroline-baserad kolorimetrisk analys
Summary
Här tillhandahålls ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader, med hjälp av en enkel, väletablerad kolorimetrisk analys som enkelt kan implementeras i de flesta laboratorier.
Abstract
Järn är ett viktigt mikronäringsmannat. Både järnöverbelastning och brist är mycket skadliga för människor, och vävnadsjärnnivåerna är fint reglerade. Användningen av experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller brist har varit avgörande för att öka kunskapen om de mekanismer som är involverade i systemisk och cellulär reglering av järnhomeostas. Mätningen av totala järnnivåer i djurvävnader utförs vanligen med atomabsorptionsspektroskopi eller med en kolorimetrisk analys baserad på reaktionen av icke-heme järn med ett bathophenanthroline reagens. Under många år har kolorimetrisk analys använts för mätning av icke-heme järnhalten i ett brett spektrum av djurvävnader. Till skillnad från atomabsorptionsspektroskopi utesluter det bidraget från heme järn som härrör från hemoglobin som finns i röda blodkroppar. Dessutom kräver det inte sofistikerade analytiska färdigheter eller mycket dyr utrustning, och kan därför enkelt implementeras i de flesta laboratorier. Slutligen kan den kolorimetriska analysen antingen vara cuvette-baserad eller anpassad till ett mikroplate-format, vilket möjliggör högre provgenomströmning. Det nuvarande arbetet ger ett väletablerat protokoll som lämpar sig för detektion av förändringar i vävnadsjärnnivåer i en mängd olika experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller järnbrist.
Introduction
Järn är ett viktigt mikronäringsmannat som krävs för funktionen hos proteiner som är involverade i viktiga biologiska processer som syretransport, energiproduktion eller DNA-syntes. Viktigt är att både järnöverskott och järnbrist är mycket skadliga för människors hälsa, och vävnadsjärnnivåerna är fint reglerade. Onormal järnabsorption via kosten, järnbrist, upprepade blodtransfusioner och kronisk inflammation är vanliga orsaker till järnrelaterade sjukdomar som påverkar miljarder människor över hela världen1,2,3.
Experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller brist har varit avgörande för att öka vår kunskap om de mekanismer som är involverade i systemisk och cellulär reglering av järnhomeostas4. Trots de betydande framsteg som gjorts under de senaste två decennierna är många viktiga aspekter fortfarande svårfångade. Under de kommande åren kommer den exakta mätningen av totala järnnivåer i djurvävnader att förbli ett kritiskt steg för att främja forskningen inom järnbiologiområdet.
De flesta laboratorier kvantifierar vävnadsjärn med antingen atomabsorptionsspektroskopi (AAS), induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS) eller en kolorimetrisk analys baserad på reaktionen av icke-heme järn med en bathophenanthroline reagens. Den senare är baserad på den ursprungliga metoden som beskrevs av Torrance och Bothwell för över 50 år sedan5,6. Medan en variation av denna metod senare utvecklades med ferrozin som ett alternativ till bathophenanthroline7, den senare är fortfarande den mest citerade chromogenic reagens i litteraturen.
Valmetoden beror ofta på tillgänglig expertis och infrastruktur. Medan AAS och ICP-MS är känsligare, är den kolorimetriska analysen fortfarande allmänt använd eftersom den ger följande viktiga fördelar: i) det utesluter bidraget från heme järn som härrör från hemoglobin som finns i röda blodkroppar; ii) Det kräver inte sofistikerade analytiska färdigheter eller mycket dyr utrustning. iii) Den ursprungliga cuvettebaserade analysen kan anpassas till ett mikroplattaformat, vilket möjliggör högre provgenomströmning. Det kolorimetriska tillvägagångssätt som presenteras i detta arbete används rutinmässigt för att kvantifiera förändringar i vävnadsjärnnivåer i en mängd olika experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller järnbrist, från gnagare till fisk och fruktfluga. Här tillhandahålls ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader, med hjälp av en enkel, väletablerad, kolorimetrisk analys som de flesta laboratorier bör hitta lätt att genomföra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader tillhandahålls, med hjälp av en anpassning av bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys som ursprungligen beskrevs av Torrance och Bothwell5,6. De kritiska stegen i metoden är vävnadstorkning; Protein denaturering och frisättning av oorganiskt järn genom syrahydrolys; Reduktion av järn (Fe3+) till järntillståndet (Fe2+) i närvaro av reduktionsmedlet tioogl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av nationella fonder genom FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projektet UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
