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Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कृन्तकों में एक क्रोहन-जैसे कोलाइटिस मॉडल के विकास का वर्णन करता है। ट्रांसम्यूरल सूजन टीएनबीएस इंस्टिलेशन साइट पर स्टेनोसिस की ओर जाता है, और स्टेनोसिस के समीपस्थ खंड में यांत्रिक वृद्धि देखी जाती है। ये परिवर्तन कोलाइटिस में यांत्रिक तनाव का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं।
Abstract
सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) जैसे कि क्रोहन रोग (सीडी) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के पुराने भड़काऊ विकार हैं जो यूरोप और संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 20 प्रति 1,00,000 को प्रभावित करते हैं। सीडी को ट्रांसम्यूरल सूजन, आंतों के फाइब्रोसिस और ल्यूमिनल स्टेनोसिस की विशेषता है। हालांकि विरोधी भड़काऊ उपचार सूजन को नियंत्रित करने में मदद कर सकते हैं, उनके पास सीडी में फाइब्रोसिस और स्टेनोसिस पर कोई प्रभावकारिता नहीं है। सीडी के रोगजनन को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। वर्तमान अध्ययन मुख्य रूप से डिस्रेगुलेटेड आंत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तंत्र को चित्रित करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। जबकि सीडी से जुड़े ट्रांसम्यूरल सूजन, आंतों के फाइब्रोसिस, और ल्यूमिनल स्टेनोसिस सभी आंत की दीवार के लिए यांत्रिक तनाव का प्रतिनिधित्व करते हैं, सीडी में यांत्रिक तनाव की भूमिका अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यांत्रिक तनाव सीडी में एक स्वतंत्र रोगजनक भूमिका निभाता है, कृन्तकों में टीएनबीएस-प्रेरित सीडी-जैसे कोलाइटिस मॉडल का एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। यह टीएनबीएस-प्रेरित ट्रांसम्यूरल सूजन और फाइब्रोसिस मॉडल बृहदान्त्र में सीडी के पैथोलॉजिकल हॉलमार्क जैसा दिखता है। यह वयस्क स्प्राग-डॉली चूहों के डिस्टल बृहदान्त्र में टीएनबीएस के इंट्राकोलोनिक इनस्टिलेटेशन द्वारा प्रेरित होता है। इस मॉडल में, ट्रांसम्यूरल सूजन टीएनबीएस इंस्टिलेशन साइट (साइट I) पर स्टेनोसिस की ओर जाता है। यांत्रिक विघटन instillation साइट (साइट पी) के समीपस्थ भाग में मनाया जाता है, यांत्रिक तनाव का प्रतिनिधित्व करता है लेकिन दिखाई देने वाली सूजन नहीं है। Colonic भाग सूजन (साइट डी) के लिए दूरस्थ न तो सूजन और न ही यांत्रिक तनाव प्रस्तुत करता है। जीन अभिव्यक्ति, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, फाइब्रोसिस, और विभिन्न साइटों (पी, आई, और डी) पर चिकनी मांसपेशियों के विकास के विशिष्ट परिवर्तन देखे गए, जो यांत्रिक तनाव के गहन प्रभाव को उजागर करते हैं। इसलिए, सीडी-जैसे कोलाइटिस का यह मॉडल हमें सीडी के रोगजनक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगा, विशेष रूप से यांत्रिक तनाव और यांत्रिक तनाव-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति की भूमिका प्रतिरक्षा विकृति, आंतों के फाइब्रोसिस और सीडी में ऊतक रीमॉडलिंग में।
Introduction
अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) और क्रोहन रोग (सीडी) सहित सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ में पुरानी सूजन की विशेषता है। यह ~ 1-2 मिलियन अमेरिकियों को प्रभावित करताहै। अमेरिका में आईबीडी देखभाल के लिए अनुमानित वार्षिक लागत $ 11.8 बिलियन है। यूसी के विपरीत, सीडी को ट्रांसम्यूरल सूजन और सख्त गठन 2,3 की विशेषता है। सख्त गठन (स्टेनोसिस) सीडी रोगियों के 70% तक होता है3 और ट्रांसम्यूरल सूजन (भड़काऊ स्टेनोसिस) या आंतों के फाइब्रोसिस (फाइब्रोटिक स्टेनोसिस) 4,5 के कारण हो सकता है। आंत्र फाइब्रोसिस अत्यधिक कोलेजन जमाव और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एसएमसी) के साथ अन्य बाह्य कोशिकीय आव्यूहों (ईसीएम) की विशेषता है, जो प्रक्रिया में शामिल मुख्य मेसेनकाइमल सेल प्रकारों में से एक के रूप मेंहै 3,4। हाइपरट्रॉफी से जुड़ी चिकनी मांसपेशी हाइपरप्लासिया सीडी6 में फाइब्रोटिक स्टेनोसिस में एक और महत्वपूर्ण हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन है। हालांकि सीडी में सख्ती का गठन पुरानी सूजन से जुड़ा हुआ है, सर्जिकल उपचार 2,6 को छोड़कर कोई विरोधी भड़काऊ उपचार प्रभावी नहीं है। हालांकि, सर्जरी के बाद की पुनरावृत्ति लगभग 100% है, पर्याप्त समय 2,7 दिया गया है। एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के रूप में, फाइब्रोसिस और एसएमसी हाइपरप्लासिया आंत 8,9 में गैर-भड़काऊ स्थितियों (यानी, आंत्र बाधा) में भी विकसित हो सकते हैं; यह माना जाता है कि दोनों सूजन-निर्भर और स्वतंत्र तंत्र सख्त गठन 3,4 में शामिल हैं। यह देखते हुए कि सूजन-निर्भर तंत्र में व्यापक शोध ने सख्ती के गठन के लिए किसी भी प्रभावी चिकित्सा में अनुवाद नहीं किया है, आंतों के फाइब्रोसिस में सूजन-स्वतंत्र तंत्र की संभावित भूमिका में अध्ययन की आवश्यकता है।
एक गैर-भड़काऊ कारक के रूप में, एडिमा, भड़काऊ सेल घुसपैठ, ऊतक विरूपण, फाइब्रोसिस, और स्टेनोसिस 10,11,12,13 से जुड़े यांत्रिक तनाव (एमएस) आमतौर पर आईबीडी, विशेष रूप से सीडी में सामना किया जाता है, जो ट्रांसम्यूरल सूजन की विशेषता है। स्टेनोटिक सीडी में यांत्रिक तनाव सबसे उल्लेखनीय है, जहां सूजन साइट में स्टेनोसिस (भड़काऊ या फाइब्रोटिक) स्थानीय ऊतक में यांत्रिक तनाव प्रस्तुत करता है और बाधा स्थल10,14 के समीपस्थ खंड में लुमेन डिस्टेंशन की ओर जाता है। पिछले इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि यांत्रिक तनाव जठरांत्र संबंधी ऊतकों में विशिष्ट भड़काऊ मध्यस्थों (यानी, COX-2, IL-6)8,14,15 और विकास कारकों (यानी, TGF-β) की जीन अभिव्यक्ति को बदल देता है, विशेष रूप से आंत चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMC)16। हाल के अध्ययनों में यह भी पाया गया कि संयोजी ऊतक विकास कारक (सीटीजीएफ) जैसे विशिष्ट प्रो-फाइब्रोटिक मध्यस्थों की अभिव्यक्ति यांत्रिक तनाव17,18 के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। यह परिकल्पना की गई थी कि यांत्रिक तनाव सीडी से जुड़ी सूजन, फाइब्रोसिस और ऊतक रीमॉडलिंग में एक स्वतंत्र रोगजनक भूमिका निभा सकता है। हालांकि, आंत की सूजन, फाइब्रोसिस, और सीडी में चिकनी मांसपेशी हाइपरप्लासिया में यांत्रिक तनाव का रोगजनक महत्व काफी हद तक अज्ञात रहता है। यह आंशिक रूप से हो सकता है क्योंकि सूजन यांत्रिक तनाव की तुलना में अधिक दृश्यमान और बेहतर अध्ययन की गई प्रक्रिया है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि आईबीडी का कोई अच्छी तरह से परिभाषित पशु मॉडल नहीं है जो यांत्रिक तनाव के प्रभाव को सूजन से अलग करता है।
वर्तमान कार्य क्रोहन की तरह कोलाइटिस के एक कृंतक मॉडल का वर्णन करता है जो हैप्टेन अभिकर्मक 2,4,6-ट्राइनाइट्रोबेंजीन सल्फोनिक एसिड (टीएनबीएस) 19,20 के इंट्राकोलोनिक इंजेक्शन से प्रेरित है, जो सीडी में यांत्रिक तनाव की भूमिका का अध्ययन करने के उद्देश्य की सेवा कर सकता है। यह पाया गया कि टीएनबीएस इनस्टिलेटेशन ने डिस्टल बृहदान्त्र में लुमेन संकीर्णता (स्टेनोसिस) के साथ एक स्थानीयकृत (~ 2 सेमी लंबाई में) ट्रांसम्यूरल सूजन को प्रेरित किया। स्टेनोसिस चिह्नित आंत्र विघटन (यांत्रिक तनाव) 14,15 की ओर जाता है, लेकिन कोलोनिक सेगमेंट में दिखाई देने वाली सूजन नहीं होती है जो इंस्टिलेशन साइट के समीपस्थ होती है। इसके विपरीत, स्टेनोसिस साइट के लिए बृहदान्त्र खंड डिस्टल न तो सूजन और न ही यांत्रिक तनाव प्रस्तुत करता है। जीन अभिव्यक्ति, सूजन, फाइब्रोसिस और एसएमसी हाइपरप्लासिया में महत्वपूर्ण साइट-विशिष्ट परिवर्तन तीन अलग-अलग साइटों में देखे गए थे। परिणाम बताते हैं कि यांत्रिक तनाव, विशेष रूप से यांत्रिक तनाव-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति, क्रोहन कोलाइटिस में फाइब्रोसिस और हाइपरप्लासिया विकसित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों को टेक्सास मेडिकल ब्रांच (#0907051C) विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार आयोजित किया गया था। नर या मादा स्प्राग-डॉली चूहों, ~ 8-9 सप्ताह पुराने, अध्ययन के लिए उपयोग किए गए थे।
1. पशु तैयारी
- 24 घंटे के लिए तेजी से चूहों और रेचक (आंत्र cleanser, सामग्री की तालिका देखें) रात भर के साथ उन्हें इलाज.
- अगले दिन, एक संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटिकाइज़ करें ( सामग्री की तालिका देखें) उन्हें टीएनबीएस प्रशासन के दौरान 1 एल / मिनट ऑक्सीजन के साथ 2% आइसोफ्लुरेन के संपर्क में लाकर। anesthetization की पुष्टि करने के लिए सजगता या चुटकी पैर की उंगलियों के लिए जाँच करें।
- शरीर के वजन के अनुसार ताजा टीएनबीएस समाधान तैयार करें।
नोट: TNBS - 40% इथेनॉल के 250 μL में शरीर के वजन के 65 मिलीग्राम / किग्रा का उपयोग किया गया था। - संज्ञाहरण तालिका पर एक सुपाइन स्थिति में चूहों रखो। कोलाइटिस को प्रेरित करने के लिए, गुदा के माध्यम से गुदा के किनारे से ~ 7-8 सेमी के लिए एक मेडिकल-ग्रेड ओपन-एंड पॉलीयुरेथेन कैथेटर डालें और धीरे से टीएनबीएस (चरण 1.3 में तैयार) को बृहदान्त्र19 में डालें। केवल खारा के 250 μL के साथ शाम नियंत्रण चूहों प्रशासन.
- टीएनबीएस या खारा पैदा करने के बाद, चूहों को सुपाइन और थोड़ा सिर-डाउन स्थिति (~ 30 डिग्री) में रखें, टीएनबीएस वितरण में मदद करने और स्पिल से बचने के लिए गुदा को 2 मिनट के लिए बंद कर दिया गया है।
- 7 दिनों के लिए भोजन और पानी विज्ञापन libitum के साथ चूहों प्रदान करें और शरीर के वजन, भोजन uptakes, मल, और सामान्य स्वास्थ्य की स्थिति के लिए दैनिक चूहों का निरीक्षण करें।
2. ऊतक तैयारी
- इच्छामृत्यु के दिन, सीओ2 साँस लेने का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत करें और गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के साथ इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
- सर्जिकल ग्रेड कैंची और संदंश का उपयोग करके चूहे के पेट को खोलें।
- ध्यान से पूरे बृहदान्त्र (गुदा नहर के ऊपर) को हटा दें और बृहदान्त्र को तुरंत बर्फ-ठंडे 1x HBSS बफर में स्थानांतरित करें।
- बफर में बृहदान्त्र को सीधा करें और एक शासक का उपयोग करके बृहदान्त्र की लंबाई को मापें। नियंत्रण और TNBS-उपचारित चूहों में बृहदान्त्र खंडों की बाहरी परिधि को मापने के लिए बृहदान्त्र के चारों ओर नायलॉन धागा और सर्कल लें। हिस्टोलॉजी के लिए पूर्ण मोटाई के ऊतकों को लें।
- Mesenteric बोर्ड के साथ बृहदान्त्र खोलें और HBSS बफर के साथ बृहदान्त्र अच्छी तरह से साफ। मापदंड के आधार पर मैक्रोस्कोपिक सूजन स्कोर के लिए बृहदान्त्र का आकलन करें जैसा कि पहले न्यूनतम संशोधनों के साथ19 वर्णित किया गया था।
नोट: 0 = सामान्य mucosa; 1 = स्थानीयकृत hyperemia लेकिन कोई कटाव या अल्सर; 2 = अल्सर और स्टेनोसिस (5 मिमी < प्रभावित क्षेत्र); 3 = गंभीर अल्सर, निशान, और स्टेनोसिस (प्रभावित क्षेत्र > 5 मिमी)। - साइट पी (सूजन साइट के मौखिक मार्जिन से पहले भाग 2-3 सेमी), साइट I (सूजन साइट, आमतौर पर बृहदान्त्र के अंत से 4-6 सेमी, जहां टीएनबीएस को डाला जाता है), और साइट डी (सूजन साइट के एबोरल मार्जिन के लिए भाग 1-2 सेमी डिस्टल), क्रमशः टीएनबीएस-उपचारित चूहों से कोलोनिक ऊतक के नमूने एकत्र करें।
नोट: ~ 1-2 सेमी-लंबे के बृहदान्त्र ऊतक प्रत्येक खंड से लिया गया था। इसके अलावा, खारा-उपचारित चूहों के 2 सेमी लंबे (बृहदान्त्र के अंत से ~ 4-6 सेमी) के बृहदान्त्र ऊतकों को शाम नियंत्रण (एस) (चित्रा 1) के रूप में लिया गया था। - पूर्ण मोटाई की तैयारी के लिए प्रत्येक साइट से ऊतक के नमूने लें, और यदि वांछित हो, तो म्यूकोसा / सबम्यूकोसा और मस्कुलरिस एक्सटर्ना परतें, क्रमशः, साथ हीसाथ 21,22।
- तरल नाइट्रोजन में ऊतक के नमूनों को एक वर्ष तक के भंडारण के लिए और भविष्य के उद्देश्यों (यानी, आरएनए तैयारी) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले पहले फ्रीज करें।
3. आंत की सूजन और फाइब्रोसिस के हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन
- 48 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में पूर्ण मोटाई वाले बृहदान्त्र ऊतकों को ठीक करें, फिर 24-48 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें।
- Hematoxylin और eosin (H &E) और Masson के Trichrome दाग 6,19,23 (सामग्री की तालिका देखें) के लिए 5 μm मोटाई के पैराफिन वर्गों को काटने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग करें।
- प्राप्त करें और संगत सॉफ्टवेयर के साथ एक उच्च संकल्प कैमरे से सुसज्जित एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को देखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- दो स्वतंत्र जांचकर्ताओं द्वारा ग्रेड सूजन और फाइब्रोसिस इंडेक्स, जिसमें एक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सर्जिकल पैथोलॉजिस्ट शामिल है, जो संशोधनों के साथ पहले 6,23 वर्णित मानदंडों के अनुसार है। स्कोर के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें।
- प्रत्येक एच एंड ई दाग नमूने के चार विचारों में प्रति क्रॉस-सेक्शन परिपत्र और अनुदैर्ध्य मांसपेशी परतों की मोटाई और सेल संख्या को मापें और प्रत्येक नमूने के लिए चार मापों का माध्य लें।
4. आरएनए निष्कर्षण और मात्रात्मक आरटी-पीसीआर
- एक आरएनए निष्कर्षण किट के निष्कर्षण अभिकर्मक में शाम नियंत्रण और तीन साइटों (पी, आई, डी) टीएनबीएस कोलाइटिस चूहों से प्राप्त बृहदान्त्र ऊतकों को homogenize ( सामग्री की तालिका देखें)।
- किट का उपयोग करने वाले प्रत्येक नमूने से आरएनए को अलग करें। RNase मुक्त पानी के 30 μL में आरएनए गोली elute.
- आरएनए एकाग्रता को मापें और एक माइक्रोवोल्यूम यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्धता की जांच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- आरएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके सीडीएनए21,22 को संश्लेषित करने के लिए कुल आरएनए के 1 μg का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- एक टेम्पलेट के रूप में cDNA के 50 ng के साथ वास्तविक समय PCR प्रदर्शन करके जीन अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करें, IL-6 की जांच, और CTGF वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम के लिए एक वाणिज्यिक पीसीआर किट का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें)।
- नमूनों को सामान्य करने के लिए नियंत्रण जीन 18S rRNA का उपयोग करें और प्राप्त Cq मूल्यों का उपयोग करके सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति को मापें।
5. सांख्यिकीय विश्लेषण
- शाम नियंत्रण और TNBS कोलाइटिस चूहों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
- 0.05 < पी मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण15,19 होने पर विचार करें।
- दो समूहों के बीच के अंतर का परीक्षण करने के लिए, छात्र के टी-टेस्ट विश्लेषण का उपयोग करें और एक एनोवा परीक्षण करें यदि तुलना दो समूहों15,19 से अधिक है।
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Representative Results
TNBS के इंट्रा-कोलोनिक instillation द्वारा प्रेरित Crohn की तरह बृहदांत्रशोथ के मैक्रोस्कोपिक दृश्य
जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, चूहों में टीएनबीएस के इंट्राकोलोनिक इनस्टिलेटेशन ने एक स्थानीयकृत ट्रांसम्यूरल सूजन (~ लंबाई में 2 सेमी) को प्रेरित किया, जिसमें मोटी आंत्र की दीवार और संकुचित लुमेन (स्टेनोसिस) डिस्टल बृहदान्त्र (चित्रा 1 ए) में इंस्टिलेशन की साइट में। TNBS instillation की साइट को साइट I के रूप में संदर्भित किया जाता है। ट्रांसम्यूरल सूजन और स्टेनोसिस के परिणामस्वरूप, सूजन और यांत्रिक तनाव दोनों साइट I में मौजूद हैं। साइट में स्टेनोसिस मैं TNBS instillation (साइट पी) (चित्रा 1) की साइट के समीपस्थ खंड में चिह्नित लुमेन distention के लिए नेतृत्व किया. बृहदान्त्र परिधि साइटों पी और मैं में काफी वृद्धि हुई थी, शाम नियंत्रण बृहदान्त्र (पी < 0.05 बनाम नियंत्रण) (चित्रा 1 बी) की तुलना में। जबकि यांत्रिक रूप से विघटित, साइट पी ने दिखाई देने वाली सूजन नहीं दिखाई। इसके विपरीत, टीएनबीएस इंस्टिलेशन साइट के लिए कोलोनिक सेगमेंट डिस्टल साइट डी है और न तो सूजन और न ही यांत्रिक विघटन (चित्रा 1 ए, बी) प्रस्तुत करता है।
सूजन से यांत्रिक तनाव के प्रभाव को अलग करने में मदद करने के लिए, हमने चरण 2.6 में वर्णित मॉडल में बृहदान्त्र से ऊतक के नमूने एकत्र करने में एक अद्वितीय डिजाइन का पालन किया। साइट पी अध्ययन का प्राथमिक फोकस है, क्योंकि यह हिस्सा सीडी मॉडल में यांत्रिक रूप से विघटित है। साइट डी आत्म-नियंत्रण है, क्योंकि यह यांत्रिक तनाव पेश नहीं करता है। साइटों पी और डी किसी भी दृश्यमान सूजन का प्रदर्शन नहीं करते हैं (चित्रा 1)। हालांकि, जिस साइट पर मैं सूजन और यांत्रिक तनाव का अनुभव करता हूं (चित्रा 1)।
कोलाइटिस चूहों में साइटों पी, आई और डी में सूजन स्कोर के साइट-विशिष्ट परिवर्तन
जीवित ऊतक (0-3)19 के मैक्रोस्कोपिक स्कोर और एच एंड ई दाग नमूनों (0-3)23 के सूक्ष्म स्कोर के आधार पर ग्रेडिंग सूजन में मानदंड विकसित किए गए थे जैसा कि संशोधनों के साथ वर्णित है। परिणामों से पता चला है कि साइट I में सूजन का मैक्रोस्कोपिक स्कोर 2.70 ± 0.20 था टीएनबीएस उपचारित चूहों (सूजन के प्रेरण के 7 दिन बाद), नाटकीय रूप से शाम नियंत्रण (0.30 ± 0.22, पी < 0.05) और साइटों पी (0.80 ± 0.26) और डी (0.50 ± 0.22) कोलाइटिस चूहों (चित्रा 1 सी) की तुलना में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई। साइटों पी और डी में सूजन स्कोर शाम (चित्रा 1 सी) की तुलना में काफी वृद्धि नहीं हुई है। माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग ने चूहों में टीएनबीएस उपचार-प्रेरित ट्रांसम्यूरल सूजन को दिखाया (चित्रा 2 ए)। साइट I में सूजन का सूक्ष्म स्कोर 2.80 ± 0.27 था TNBS उपचारित चूहों में, फिर से काफी (पी < 0.05, एन = 5 प्रत्येक समूह) शाम नियंत्रण (0.3 ± 0.2) और साइटों पी (1.0 ± 0.31) और डी (0.80 ± 0.38) कोलाइटिस चूहों की तुलना में वृद्धि हुई। साइटों पी और डी में सूजन स्कोर शाम (चित्रा 2 सी) की तुलना में काफी वृद्धि नहीं हुई थी।
फाइब्रोसिस और चिकनी मांसपेशी हाइपरप्लासिया और साइटों में हाइपरट्रॉफी के साइट-विशिष्ट परिवर्तन पी, आई, और कोलाइटिस चूहों में डी
फाइब्रोसिस स्कोर मेसन के ट्राइक्रोम दाग (चित्रा 2 बी) के आधार पर विभिन्न साइटों (पी, आई, डी) (चित्रा 2 ए) में निर्धारित किया गया था। फाइब्रोसिस के लिए ग्रेडिंग प्रणाली को पूरक फ़ाइल 1 में वर्णित किया गया है। यह पाया गया कि फाइब्रोसिस स्कोर न केवल साइट I (2.60 ± 0.25) में, बल्कि कोलाइटिस चूहों की साइट पी (1.60 ± 0.24) में भी काफी बढ़ गया है, शाम नियंत्रण (0.40 ± 0.25) की तुलना में। पी < 0.05) (चित्रा 2 डी)। परिपत्र और अनुदैर्ध्य चिकनी मांसपेशियों की परतों की मोटाई और सेल संख्या को एच एंड ई दाग वाले नमूनों (प्रति नमूना 4 दृश्य) में विभिन्न साइटों में मापा गया था। दोनों परिपत्र और अनुदैर्ध्य चिकनी मांसपेशी परतों की मोटाई और सेल संख्या साइटों I और P (चित्रा 2E, F) में काफी वृद्धि हुई थी। कोलाइटिस चूहों में साइट डी फाइब्रोसिस स्कोर, चिकनी मांसपेशी कोशिका संख्या, या मांसपेशियों की मोटाई (चित्रा 2) में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं दिखाती है।
कोलाइटिस चूहों में साइटों पी, आई और डी में मेचानो-संवेदनशील जीन की साइट-विशिष्ट अभिव्यक्ति
आईएल -6 आंत की सूजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि यह टी सेल भेदभाव को बढ़ावा देता है, बाधा समारोह को नुकसान पहुंचाता है, और न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन 8,24 को प्रभावित करता है। सीटीजीएफ एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त प्रो-फाइब्रोटिक मध्यस्थ है, क्योंकि इसका निषेध फाइब्रोसिस17 की प्रक्रिया को उलट सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि हाल के अध्ययनों में पाया गया कि आईएल -6 और सीटीजीएफ की जीन अभिव्यक्ति यांत्रिक तनाव 8,14,18 के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है। आईएल -6 और सीटीजीएफ एमआरएनए की साइट-विशिष्ट अभिव्यक्ति को शाम नियंत्रण और टीएनबीएस कोलाइटिस चूहों के पूर्ण मोटाई ऊतक में निर्धारित किया गया था। आईएल -6 और सीटीजीएफ के एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर को शाम नियंत्रण की तुलना में सूजन साइट (साइट I) में काफी वृद्धि हुई थी। साइट पी में, जहां यांत्रिक विचलन है, लेकिन कोई दिखाई देने वाली सूजन नहीं है, आईएल -6 और सीटीजीएफ की एमआरएनए अभिव्यक्ति भी नियंत्रण चूहों (चित्रा 3 ए, बी) की तुलना में नाटकीय रूप से बढ़ गई थी। हालांकि, कोलाइटिस चूहों की साइट डी में आईएल -6 और सीटीजीएफ एमआरएनए का स्तर शाम नियंत्रण (चित्रा 3) से काफी अलग नहीं था।
चित्रा 1: TNBS-प्रेरित CD-like बृहदांत्रशोथ (7 दिन) का कृंतक मॉडल. (A) शाम नियंत्रण और TNBS-उपचारित बृहदान्त्र (शीर्ष) का आउटलुक दृश्य और डिस्टल बृहदान्त्र (नीचे) की म्यूकोसल सतह का मैक्रोस्कोपिक दृश्य। पीले बक्से बृहदान्त्र ऊतक के विभिन्न स्थलों को इंगित करते हैं। एस, शाम नियंत्रण; मैं, सूजन साइट; पी, सूजन साइट के समीपस्थ बृहदान्त्र साइट; डी, गैर distended साइट सूजन के लिए डिस्टल. (बी) शाम नियंत्रण में बृहदान्त्र परिधि और टीएनबीएस-उपचारित बृहदान्त्र के विभिन्न स्थलों (पी, आई, डी)। (सी) शाम नियंत्रण बृहदान्त्र और टीएनबीएस-उपचारित बृहदान्त्र के विभिन्न स्थलों का मैक्रोस्कोपिक सूजन स्कोर। n = 5, * p < 0.05 बनाम समूह के शाम चूहों. पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन। एच एंड ई (ए) और मैसन के ट्राइक्रोम दाग (बी) में सूक्ष्म विचार शाम और कोलाइटिस चूहों की विभिन्न साइटों में कोलेजन वितरण दिखाते हैं। मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि बढ़ी हुई सूक्ष्म सूजन सूचकांक (सी), फाइब्रोसिस (डी) और मांसपेशियों की मोटाई (हाइपरट्रॉफी) (ई), और चिकनी मांसपेशी कोशिका संख्या (हाइपरप्लासिया) (एफ) साइटों में आई और पी, लेकिन टीएनबीएस उपचारित चूहों में डी नहीं। (ई) और (एफ) में, खुली सलाखों परिपत्र चिकनी मांसपेशी परत के लिए हैं, और लकीरदार सलाखों अनुदैर्ध्य चिकनी मांसपेशी परत के लिए कर रहे हैं। n = 5 प्रत्येक समूह में, * पी < 0.05 बनाम। समूह के नकली चूहे। रेखांकन में पट्टियाँ SEM को दर्शाती हैं। (A) और (B) में पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: CD-जैसे बृहदांत्रशोथ में mechanosensitive जीन (IL-6 और CTGF) की साइट-विशिष्ट अभिव्यक्ति। (A) शाम नियंत्रण बृहदान्त्र में IL-6 mRNA की अभिव्यक्ति और TNBS-उपचारित कोलाइटिस बृहदान्त्र के विभिन्न साइटों (P, I, और D) की अभिव्यक्ति। (बी) शाम नियंत्रण बृहदान्त्र में सीटीजीएफ एमआरएनए की अभिव्यक्ति और टीएनबीएस-उपचारित कोलाइटिस बृहदान्त्र के विभिन्न स्थलों (पी, आई, और डी) की अभिव्यक्ति। n = 4 या 5, * p < 0.05 बनाम। एस (शाम नियंत्रण)। पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 1: सूजन और फाइब्रोसिस का स्कोर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
टीएनबीएस-प्रेरित कोलाइटिस को 1989 में पेश किया गया था और तब से19,20,23 के बाद से क्रोहन रोग के एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। कृन्तकों में इस मॉडल की महत्वपूर्ण विशेषताओं में एक ट्रांसम्यूरल सूजन का विकास शामिल है जो मानव क्रोहन रोग19,20 में विकसित हिस्टोपैथोलॉजिकल घावों से मिलता-जुलता है। मॉडल पर पिछले अध्ययनों ने मुख्य रूप से दृश्यमान सूजन (साइट I) 19,20,23 की साइट में म्यूकोसा परत में अनियमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है। आंत्र भागों के समीपस्थ और सूजन के लिए डिस्टल पर थोड़ा ध्यान दिया गया है। सूजन साइट पर वर्तमान अध्ययन, साथ ही साथ विघटित समीपस्थ खंड और गैर-विघटित डिस्टल सेगमेंट, जीन अभिव्यक्ति, भड़काऊ प्रतिक्रिया और हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं में स्पष्ट साइट-विशिष्ट परिवर्तनों का खुलासा करता है। मॉडल को फाइब्रोसिस में यांत्रिक तनाव की संभावित रोगजनक भूमिका को संबोधित करने के लिए फिर से देखा गया है और क्रोहन रोग में ऊतक रीमॉडलिंग।
यह पाया गया कि तीव्र सूजन तुरंत इथेनॉल में टीएनबीएस के म्यूकोसल एक्सपोजर के बाद विकसित होती है और दिन 319 पर चरम पर होती है। ट्रांसम्यूरल सूजन और भड़काऊ स्टेनोसिस मौजूद हैं, जो टीएनबीएस के साथ इलाज किए गए प्रत्येक चूहे में साइट पी में लुमेन डिस्टेंशन से जुड़ा हुआ है। दिन 7 तक, पुरानी ट्रांसम्यूरल सूजन साइट I में अच्छी तरह से विकसित होती है, जैसा कि वर्तमान अध्ययन में पाया गया है और कहीं और20 की सूचना दी गई है। इस बीच, साइट में फाइब्रोटिक परिवर्तन स्पष्ट हैं, जो अत्यधिक कोलेजन जमाव की विशेषता है, जैसा कि वर्तमान अध्ययन और अन्य जगहोंपर देखा गया है। डिस्टल बृहदान्त्र में इथेनॉल में टीएनबीएस instillation स्थानीय म्यूकोसा ऊतक23 को घायल कर देता है और बृहदान्त्र में एक स्थानीयकृत क्षेत्र में transmural सूजन की ओर जाता है। भड़काऊ घुसपैठ, एडिमा, और ऊतक विरूपण के साथ ट्रांसम्यूरल सूजन 10,12,13 instillation साइट में सूजन और यांत्रिक तनाव14 स्थानीयकृत क्षेत्र (साइट I) के लिए प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, ट्रांसम्यूरल सूजन भी साइट I10 में ल्यूमिनल स्टेनोसिस का कारण बनती है। यह पाया गया कि स्टेनोसिस, एक आंशिक आंत्र बाधा, समीपस्थ खंड (साइट पी) में यांत्रिक विघटन का कारण बनता है। हालांकि, instillation साइट के लिए दूरस्थ भाग distended (साइट डी) नहीं है। जैसा कि मैक्रोस्कोपिक और हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग सिस्टम में पाया जाता है, जबकि साइट मैं सूजन और यांत्रिक तनाव दोनों को प्रस्तुत करता हूं, साइटें पी और डी सूजन पेश नहीं करती हैं। इसके अलावा, साइट पी काफी बढ़ी हुई परिधि दिखाती है (और इस प्रकार यांत्रिक तनाव, लाप्लास14 के कानून के अनुसार), लेकिन साइट डी नहीं करता है। इसलिए, साइट-विशिष्ट परिवर्तनों पर एक अध्ययन, विशेष रूप से साइट पी, आंत में सूजन मॉडल में यांत्रिक तनाव के रोगजनक महत्व का पता लगाएगा।
यह देखा गया कि मेचानो-संवेदनशील जीन आईएल -6 और सीटीजीएफ की अभिव्यक्ति साइट I और यांत्रिक रूप से फैली हुई साइट पी में बढ़ गई थी, लेकिन पड़ोसी साइट डी में नहीं, जहां कोई यांत्रिक विघटन नहीं है। परिकल्पना की जांच करने के लिए कि यांत्रिक तनाव फाइब्रोसिस और चिकनी मांसपेशी हाइपरप्लासिया के विकास में योगदान कर सकता है, फाइब्रोसिस स्कोर और साइटों पी, आई और डी में चिकनी मांसपेशी कोशिका संख्या और मांसपेशियों की मोटाई को मापा गया था, अलग से निर्धारित किया गया था। यह पाया गया कि फाइब्रोसिस और एसएमसी हाइपरप्लासिया साइटों I और P में मौजूद हैं। हालांकि, फाइब्रोसिस और चिकनी मांसपेशी हाइपरप्लासिया साइट डी में नहीं पाए जाते हैं। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि यांत्रिक तनाव आंत की सूजन में कोलेजन संश्लेषण और कोशिका प्रसार में एक स्वतंत्र रोगजनक भूमिका निभा सकता है। आगे के अध्ययनों को यह निर्धारित करने के लिए वारंट किया जाता है कि क्या इस प्रभाव को साइटों पी और आई में सीटीजीएफ जैसे प्रो-फाइब्रोटिक और विकास कारकों की यांत्रिक तनाव-प्रेरित अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है।
यद्यपि वर्णित पशु मॉडल का उपयोग स्टेनोटिक सीडी-जैसे कोलाइटिस में यांत्रिक तनाव को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन सूजन में यांत्रिक तनाव की रोगजनक भूमिका को पूरी तरह से परिभाषित करने के लिए दीर्घकालिक लक्ष्य में इसकी सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, वर्णित मॉडल की साइट I में यांत्रिक तनाव और सूजन के प्रभावों को विभेदित नहीं किया जा सकता है। यद्यपि यह माना जाता है कि यांत्रिक तनाव भड़काऊ घुसपैठ, ऊतक विरूपण, स्टेनोसिस और विघटन के कारण साइट I में मौजूद है, लेकिन वहां के रोग संबंधी परिवर्तनों में कितना यांत्रिक तनाव योगदान देता है, यह निर्धारित नहीं किया जा सकता है। इन विट्रो, इन विवो और एक्स वीवो दृष्टिकोण का उपयोग करके आगे के व्यापक अध्ययन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, कोलाइटिस जानवरों को विशेष रूप से एक स्पष्ट तरल आहार25 के साथ खिलाकर यांत्रिक विघटन को रोकने से कोलाइटिस मॉडल में नुकसान-के-यांत्रिक विघटन की स्थिति बनाने में मदद मिल सकती है। दूसरी ओर, रुकावट बैंड15 द्वारा शुद्ध यांत्रिक विघटन का प्रेरण एक लाभ-के-यांत्रिक तनाव मॉडल बनाने में मदद कर सकता है। इसके अलावा, सुसंस्कृत कोशिकाओं में इन विट्रो मैकेनिकल स्ट्रेच मॉडल14,15 जीन अभिव्यक्ति और कार्य पर यांत्रिक तनाव के प्रभावों के मात्रात्मक निर्धारण में सहायता करता है, क्योंकि यांत्रिक तनाव के मोड और सीमा को इन विट्रो सेटिंग में बारीकी से नियंत्रित किया जा सकता है।
अध्ययन में वर्णित सीडी-जैसे कोलाइटिस में ट्रांसम्यूरल और स्टेनोटिक सूजन का एक पुनरुत्पादक मॉडल तैयार करने के लिए, 40% इथेनॉल के 250 μL में 65 मिलीग्राम / किलोग्राम पर टीएनबीएस का उपयोग किया जाना चाहिए। मॉडल का परीक्षण मुख्य रूप से चूहों, नर या मादा, 8-9 सप्ताह पुराने में किया गया था। खुराक पर टीएनबीएस के instillation के बाद, transmural सूजन लगातार स्थानीय instillation साइट पर विकसित किया जाता है। सूजन भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ, एडिमा और आंत्र की दीवार मोटा होने के साथ जुड़ी हुई है, जिससे क्रोहन रोग20 की रोग संबंधी विशेषताओं के समान, इंस्टिलेशन साइट पर लुमेन संकीर्ण हो जाता है। प्रयोगशाला में पायलट अध्ययनों से पता चला है कि 40% इथेनॉल की एक ही मात्रा में 50 मिलीग्राम / किलोग्राम से कम खुराक पर टीएनबीएस आंत की सूजन का कारण बन सकता है लेकिन साइट I में विश्वसनीय स्टेनोसिस नहीं है। इस प्रकार, साइट पी में कोई स्पष्ट यांत्रिक विघटन नहीं होगा। दूसरी ओर, 80 मिलीग्राम / किग्रा से अधिक खुराक पर टीएनबीएस गंभीर सूजन और मृत्यु का कारण बन सकता है। 40% इथेनॉल के 250 μL में 65 मिलीग्राम / किग्रा पर टीएनबीएस का उपयोग करने वाला वर्तमान प्रोटोकॉल शायद ही कभी मृत्यु का कारण बनता है (टीएनबीएस कोलाइटिस के 16 चूहों में से 1)।
यह पाया गया कि टीएनबीएस के इंस्टिलेशन से एक दिन पहले आंत्र सफाई स्टेनोटिक कोलाइटिस के एक विश्वसनीय मॉडल के लिए अपेक्षाकृत स्वच्छ बृहदान्त्र सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इसके लिए, चूहों को 24 घंटे के लिए उपवास करने और टीएनबीएस उपचार से पहले रात भर आंत्र क्लींजर देने की आवश्यकता होती है। टीएनबीएस के इंस्टिलेशन के बाद 2 मिनट के लिए गुदा बंद होने के साथ चूहों को एक सुपाइन और थोड़ा सिर-नीचे की स्थिति में रखना भी महत्वपूर्ण है। यह डिस्टल बृहदान्त्र के अंदर टीएनबीएस का एक अच्छा वितरण सुनिश्चित करने में मदद करता है।
संक्षेप में, यह पाया गया कि 40% इथेनॉल के 250 μL में 65 मिलीग्राम / किग्रा पर टीएनबीएस के इंट्राकोलोनिक इंस्टिलेशन ने चूहों में सीडी जैसी कोलाइटिस को लगातार प्रेरित किया। मॉडल में ट्रांसम्यूरल सूजन टीएनबीएस इंस्टिलेशन साइट पर स्टेनोसिस से जुड़ी हुई है। यांत्रिक विघटन, लेकिन सूजन नहीं, स्टेनोसिस के समीपस्थ खंड में मनाया जाता है। न तो सूजन और न ही यांत्रिक तनाव स्टेनोसिस के लिए दूरस्थ खंड में मौजूद है। कोलाइटिस चूहे में विभिन्न बृहदान्त्र साइटों में इन परिवर्तनों के साथ, सीडी जैसे कोलाइटिस में सूजन से यांत्रिक तनाव को अलग किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है और उनके पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह काम एनआईएच (R01 DK124611 से XZS) और अमेरिकी रक्षा विभाग (W81XWH-20-1-0681 से XZS) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित है। यूटीएमबी सर्जिकल पैथोलॉजी लैब की मदद से हिस्टोलॉजी का काम किया गया था।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 181Erratum
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.