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Bioengineering

Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Inaktivierung pathogener Bakterien mit reaktiven Sauerstoffspezies vor, die während der Photolyse von Flavinmononukleotid (FMN) unter blauer und violetter Lichtbestrahlung niedriger Intensität entstehen. Die FMN-Photolyse hat sich als einfache und sichere Methode für hygienische Prozesse erwiesen.

Abstract

Riboflavin-5'-phosphat (oder Flavinmononukleotid; FMN) ist empfindlich gegenüber sichtbarem Licht. Verschiedene Verbindungen, einschließlich reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), können durch FMN-Photolyse bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht erzeugt werden. Die durch FMN-Photolyse erzeugten ROS sind schädlich für Mikroorganismen, einschließlich pathogener Bakterien wie Staphylococcus aureus (S. aureus). Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Deaktivierung von S. aureus als Beispiel durch photochemische Reaktionen vor, an denen FMN unter Bestrahlung mit sichtbarem Licht beteiligt ist. Das bei der FMN-Photolyse erzeugte Superoxid-Radikal-Anion () wird mittels Nitroblautetrazolium (Equation 1NBT)-Reduktion ausgewertet. Die mikrobielle Lebensfähigkeit von S. aureus, die reaktiven Equation 1 Spezies zugeschrieben wird, wurde verwendet, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu bestimmen. Die bakterielle Inaktivierungsrate ist proportional zur FMN-Konzentration. Violettes Licht ist bei der Inaktivierung von S. aureus effizienter als die Bestrahlung mit blauem Licht, während das rote oder grüne Licht die FMN-Photolyse nicht antreibt. Der vorliegende Artikel demonstriert die FMN-Photolyse als einfache und sichere Methode für sanitäre Prozesse.

Introduction

Riboflavin-5′-phosphat (FMN) entsteht durch Phosphorylierung an der Riboflavin-5′-Position der Ribitylseitenkette und wird von allen Flavoproteinen für zahlreiche zelluläre Prozesse zur Energiegewinnung benötigt. Es spielt auch die Rolle des Vitamins für einige Funktionen im menschlichen Körper1. FMN ist etwa 200-mal wasserlöslicher als Riboflavin2.

Die antibakterielle photodynamische Inaktivierung (aPDI) von Bakterien ist ein wirksames Mittel zur Kontrolle der Resistenz gegen Bakterien3,4, da sie nicht von der Art der bakteriellen Resistenz abhängt. Klinisch wird aPDI zur Behandlung von Weichteilinfektionen eingesetzt, um die Infektion der nosokomialen Haut durch multiresistente Bakterienzu verringern 5,6,7,8,9. aPDI erzeugt auch den Zelltod, indem es reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt. ROS, wie Superoxidradikale (), Singulett-Sauerstoff, Hydroxylradikale (Equation 1•OH) und Peroxyl-Radikale, sind freie Radikale oder Moleküle, die reaktiven Sauerstoff 10,11,12 enthalten und normalerweise reaktiv sind 13. Ähnlich wie DNA-Schäden, die durch ROS verursacht werden, sind auch die Membranperoxidation und die Zerstörung von Endothelzellen nachteilige biochemische Reaktionen, die auf ROS in Zellenzurückzuführen sind 12.

Die Verwendung von aPDI für pathogene Bakterien beinhaltet eine sichtbare oder UV-Lichtquelle zur Inaktivierung von Mikroorganismen in Gegenwart chemischer Verbindungen wie Methylthioniniumchlorid 14, PEI-c e6-Konjugat 15, Porphyrin16, Titandioxid 17, Toluidinblau O 18 und Zinkoxid-Nanopartikel 19. Toluidinblau O und Methylenblau sind Phenothiaziniumfarbstoffe und Methylenblau hat toxische Eigenschaften. Zinkoxid-Nanopartikel und UV-Strahlung sind mit negativen Auswirkungen auf Gesundheit und Umwelt verbunden. Daher verdient die Nutzung eines zuverlässigen, sicheren und einfachen Photosensibilisators durch Photolyse unter sichtbarer Bestrahlung weitere Untersuchungen.

Der Mikronährstoff, Riboflavin oder FMN, ist nicht toxisch und wird in der Tat für die Lebensmittelherstellung oder Fütterungverwendet 20. Sowohl FMN als auch Riboflavin sind sehr empfindlich gegenüber Lichteinstrahlung2. Unter UV 1,2,21,22,23 und Blaulichteinstrahlung 10,24 erreichen diese beiden Verbindungen einen angeregten Zustand. Das aktivierte Riboflavin oder FMN, das durch Photolyse erzeugt wird, wird in seinen Triplett-Zustand befördert und ROS werden gleichzeitigerzeugt 2,25. Kumar et al. berichteten, dass Riboflavin, das durch UV-Licht aktiviert wird, selektiv eine erhöhte Schädigung des Guanin-Anteils der DNA in pathogenen Mikroorganismen verursacht26. Unter Bestrahlung mit UV-Licht wird gezeigt, dass photodynamisch aktiviertes Riboflavin die Bildung von 8-OH-dG, einem Biomarker für oxidativen Stress, in doppelsträngiger DNAfördert 27. Es wird berichtet, dass S. aureus und E. coli während der Riboflavin- oder FMN-Photolyse durch ROS deaktiviert werden10,24,28. Eine frühere Studie der Autoren zeigte, dass die photolytischen Reaktionen mit Riboflavin und FMN Kristallviolett, einen Triarylmethanfarbstoff und ein antibakterielles Mittel, das Kristallviolett erzeugt und den größten Teil der antimikrobiellen Fähigkeit von Kristallviolett28 erzeugtEquation 1, reduzieren und eliminieren. Wenn Flavin-Adenin-Dinukleotid oder FMN mit blauem Licht bestrahlt wird, erzeugen die resultierenden ROS Apoptose in HeLa-Zellen für ihre Vergiftung in vitro29. Unter Verwendung einer photochemischen Behandlung in Gegenwart von Riboflavin inaktivierten Cui et al. Lymphozyten durch Hemmung ihrer Proliferation und Zytokinproduktion30.

Die Photolyse von Riboflavin wird zur Inaktivierung von Blutpathogenen durch UV 10,24 verwendet, jedoch können Blutbestandteile unter UV-Lichtbestrahlung beeinträchtigt werden30. Es wird auch berichtet, dass Thrombozyten, die UV-Strahlung ausgesetzt sind, die Leistung der Aktivierungsmarker P-Selektin und LIMP-CD63 auf ihren Membranen progressiv verbessern. Die Zytotoxizität von UV- und hochintensiver Bestrahlung muss untersucht werden, und ein Photosensibilisator, der während einer FMN-Photoreaktion mit sichtbarem Licht unkompliziert und sicher ist, wäre von großem Nutzen.

Licht kürzerer Wellenlängen hat mehr Energie und verursacht viel eher schwere Schäden an Zellen. In Gegenwart eines geeigneten Photosensibilisators kann die Bestrahlung mit violettem Licht geringer Intensität jedoch pathogene Mikroorganismen hemmen. Die Photosensibilisierung und die Erzeugung von FMN bei Bestrahlung mit violettem Licht ist daher wichtig zu untersuchen, um den Weg zu bestimmen, auf dem ROS aus der FMN-Photolyse die Inaktivierung von Equation 1 Bakterien erhöht.

Antimikrobielle Kontrolle ist ein häufiges Problem und die Entwicklung neuer Antibiotika dauert oft Jahrzehnte. Nach der Bestrahlung mit violettem Licht kann die Photoinaktivierung, die durch FMN vermittelt wird, umweltpathogene Bakterien vernichten. Diese Studie stellt ein wirksames antimikrobielles Protokoll in vitro vor, das violettes Licht verwendet, um die FMN-Photolyse zu steuern und somit für aPDI zu erzeugen Equation 1 . Die mikrobielle Lebensfähigkeit von S. aureus wird verwendet, um die Machbarkeit von FMN-induziertem aPDI zu bestimmen.

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Protocol

1. Einrichtung des Photolysesystems

  1. Sechs Leuchtdioden (LED) (DC 12 V) werden an der Innenseite eines undurchsichtigen Kunststoffbechers (8 cm x 7 cm) montiert, wie in Figur 1 gezeigt, um ein Photolysesystem31 einzurichten.
  2. Geben Sie Reaktanten (siehe unten) in die Glasreagenzgläser (13 mm Durchmesser und 100 mm Höhe) und befestigen Sie die Röhrchen oben im Becher, wie in Abbildung 1 gezeigt. Stellen Sie den Versuchsaufbau in einen Raum mit einer konstanten Temperatur von 25 ± 3 °C.
  3. Überwachen und erfassen Sie die Temperatur der Testeinheiten während der photolytischen Reaktionen mit einem Infrarot-Thermometer.
    HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Emissionsspektren für blaues, grünes, rotes und violettes Licht, wie sie mit einem kalibrierten optischen UV-Vis-Spektrometer aufgezeichnet wurden. Die Wellenlängen, die dem Extinktionsmaximum für blaue, grüne, rote und violette LED-Lichter entsprechen, die in der Studie verwendet wurden, sind 465, 529, 632 bzw. 405 nm. Die LED-Chips können die Apparatur bei Bestrahlungsexperimenten erwärmen. Das gesamte Photoreaktionssystem wurde daher in jedem Experiment in einem Raum platziert, in dem die Temperatur konstant bei 25 ± 3 °C gehalten wurde.

2. Der Einfluss der Lichtwellenlänge auf die Photolyse von FMN (Abbildung 3)

  1. Bereiten Sie eine 0,1 mM FMN-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (PB) (pH 7,8) vor. Belichten Sie FMN-Proben (jeweils 3 ml) 5 Minuten lang blauem, grünem, rotem oder violettem Licht mit einer Intensität von 10 W/m2 . Bewahren Sie 3 ml FMN-Lösung als Kontrolle im Dunkeln auf.
  2. Aufzeichnung der Absorption von bestrahlten FMN-Proben im Bereich von 250-750 nm mit einem UV/Visible-Spektralphotometer.

3. Nitroblautetrazolium (NBT)-Reduktionsmethode zum Nachweis Equation 1 (Abbildung 4).

ANMERKUNG: Die hier verwendete NBT-Reduktionsmethode wurde gegenüber dem Assay für Riboflavin-Photoreaktion leicht modifiziert. Die NBT-Reduktionsmethode wird verwendet, um das Niveau der durch die FMN-Photolyse erzeugten Equation 1 Werte zu bewerten. Das photochemisch angeregte FMN wird zunächst durch L-Methionin zu einem Semichinon reduziert, das dann ein Elektron an Sauerstoff abgibt, wodurch 31 entstehtEquation 1. Das erzeugte Equation 1 NBT reduziert zu Formazan, das eine charakteristische Absorption bei 560 nm32 aufweist.

  1. Fügen Sie 109,3 mg L-Methionin zu 73,3 ml PB (100 mM; pH 7,8) hinzu. Vortex die Lösung, um das L-Methionin aufzulösen.
  2. Nachdem das L-Methionin vollständig aufgelöst ist, fügen Sie der Lösung 10 mg NBT-Pulver und 1,53 ml 0,117 mM FMN hinzu. Für jeden 1 ml der Reaktionslösung (d. h. eine Mischung aus FMN, L-Methionin und NBT) betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M bzw. 1,6 x 10-4 M.
  3. Die Reaktionslösung (1 ml) wird 1-5 min lang blauer oder violetter LED-Lichtbestrahlung bei 10 W/m2 ausgesetzt.
  4. Detektieren Sie die Spezies (aus der Absorption bei 560 nm), die durch die photochemische Reaktion erzeugt wird, die Equation 1 NBT reduziert und Formazan produziert.

4. Lebensfähigkeit von S. aureus nach FMN-Photolyse (Abbildung 5)

  1. Eine Kolonie von S. aureus (BCRC 10451) wird von einer kultivierten Platte in 10 ml Lysogenbrühe übertragen, die in einem 15-ml-Reagenzglas mit Schraubverschluss entnommen wird. Kultur in einem Shaker bei 37 °C für 16 h.
  2. Übertragen Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Geben Sie sterilisiertes Wasser in das Zentrifugenröhrchen, um die Kultur auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 KBE/ml) zu verdünnen.
  3. Geben Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 14.000 x g und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.
  4. Fügen Sie 1 ml FMN-gepufferte Lösung (30, 60 und 120 μM FMN in PB) zu den wie in Schritt 4.3 erhaltenen Zellpellets hinzu und wirbeln Sie aus. Für die Bestrahlungskontrolle fügen Sie 1 ml PB allein hinzu.
  5. Übertragen Sie je 1 ml lebensfähige bakterielle Zelllösungen, die nur 30 μM FMN und PB enthalten, in Glasröhrchen und bestrahlen Sie sie mit violettem Licht bei 10 W/m2 für 30 min.
  6. Übertragen Sie jeweils 1 ml lebensfähiger bakterieller Zelllösungen, die 30, 60 und 120 μM FMN und PB enthalten, in Glasröhrchen und bestrahlen Sie sie mit blauem Licht bei 20 W/m2 für 120 min. Stellen Sie ein weiteres Glasröhrchen mit 1 ml lebensfähiger Bakterienzelllösung auf, die 120 μM FMN enthält, und bestrahlen Sie es 60 Minuten lang mit blauem Licht bei 20 W/m2 .
  7. Stellen Sie die Reagenzgläser wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben auf und decken Sie sie mit dicken Aluminiumfolien ab. Diese Röhren dienen als Dunkelregler.
  8. Bewahren Sie die Bestrahlungskammer (sowie die Dunkelregler) während der Bestrahlungszeit von 30-120 min in einem Kühlraum bei 9 ± 1 °C auf.
    HINWEIS: Die von LED-Leuchten freigesetzte Wärme kann nicht ignoriert werden, da die im Inneren des Bechers platzierten LED-Chips das Photoreaktionssystem während der Bestrahlungsexperimente erwärmen können. Die Versuche wurden daher in einem Kühlraum bei 9 ± 1 °C durchgeführt.
  9. Nach der Bestrahlung werden 0,2 ml aus jeder der Reaktionslösungen auf eine Luria-Agarplatte (LA) übertragen. Die Bakterien mit einem L-förmigen Glasstab auf der Platte verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  10. Berechnen Sie die lebensfähige Keimzahl und die Inaktivierungsraten von S. aureus nach nächtlichem Wachstum.
    ANMERKUNG: Die Inaktivierungsrate von S. aureus wird als prozentuale Reduktion berechnet, die [1 -I / D] ×100% entspricht, wobei I und D die Anzahl der KBE in der bestrahlten Probe bzw. der Dunkelkontrolle bezeichnen. Die prozentuale Minderung ist definiert als negativer Wert der Inaktivierungsrate.

5. Nachweis von Equation 1 In S. aureus (Abbildung 6)

  1. Bereiten Sie die S. aureus-Proben wie in Schritt 4 beschrieben vor.
  2. Die Bakteriendichte der Proben wird mit sterilisiertem Wasser auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD600, ~6 x 106 KBE/ml) verdünnt. Übertragen Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 14.000 x g für 10 min und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.
  3. Fügen Sie 0,1093 g L-Methionin, 0,1 g NBT und 25 ml FMN (400, 240 oder 120 μM) zu 75 ml PB hinzu. Für jeden 1 ml des applizierten Reaktanten betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 100 (60 oder 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M bzw. 1,2 x 10-3 M.
  4. 1 ml jeder Reaktantenlösung (d. h. mit unterschiedlichen FMN-Konzentrationen) zu den wie in Schritt 5.2 erhaltenen Zellpellets zugeben. Bestrahlen Sie die Lösungen mit violettem Licht bei 10 W/m2 für 10 min.
  5. Das Gemisch wird bei 14.000 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), um das reduzierte NBT zu extrahieren. Die erzeugten Equation 1 Spezies werden aus der Absorption bei 560 nm nachgewiesen.

6. Statistische Auswertung

  1. Drücken Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen Tests aus.
  2. Wenden Sie einen homoskedastischen Zweistichproben-t-Test an, um zu beurteilen, ob zwei Messungen unterschiedlich sind. p-Werte < 0,05 gelten als statistisch signifikant.

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Representative Results

Einfluss der Lichtwellenlänge auf FMN
Die Absorptionsspektren von 0,1 mM FMN, die mit blauen, grünen, roten und violetten LEDs bestrahlt werden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt zwei Peaks für FMN (372 nm und 444 nm) für die Dunkelkontrolle. Grünes und rotes Licht haben keine Wirkung, da Änderungen in den Spektren unbedeutend sind. Auf der anderen Seite ist die jeweilige Absorption von FMN bei 444 nm nach blauer und violetter Lichtbestrahlung bei 10 W/m2 für 5 min um etwa 19% bzw. 34% reduziert, was darauf hindeutet, dass die Bestrahlung mit blauem/violettem Licht die FMN-Photolyse erhöht.

Detektion von Equation 10 von FMN, das mit blauem oder violettem Licht bestrahlt wird
Die NBT-Reduktion wurde verwendet, um die Bildung von Equation 132 zu bestimmen. FMN ist auch für kurze Strahlungsperioden sehr empfindlich gegenüber sichtbarem und UV-Licht. Equation 1 entsteht aus den intermediären photochemischen Reaktionen während der Photolyse von FMN. Abbildung 4 zeigt, dass der photochemische Effekt von FMN auf die NBT-Reduktion von der Bestrahlungszeit abhängt, wie Equation 1 sie aus FMN gebildet wird, das in Abhängigkeit von der Bestrahlung mit blauem oder violettem Licht erfolgt. Der durchschnittliche photolytische Effekt von blauem und violettem Licht ist jedoch ähnlich wie in Abbildung 4 dargestellt.

Wirkung der FMN-Photolyse auf die Lebensfähigkeit von S. aureus
Die Wirkung von FMN, das bei violetter oder blauer Bestrahlung exponiert wurde, auf die Lebensfähigkeit von S. aureus wurde bestimmt. Die FMN-Photolyse mit blauem oder violettem Licht führt zu einer signifikanten Inaktivierung von S. aureus. Je höher die Konzentration von FMN ist, desto höher ist die Inaktivierungsrate von S. aureus, das 120 Minuten lang blauer Lichtbestrahlung bei 20 W/m2 ausgesetzt wird, wie in Abbildung 5A dargestellt. Inaktivierungsraten von 26 %, 39 %, 43 % und 97 % wurden für S. aureus unter Verwendung von 0, 30, 60 bzw. 120 μM FMN unter 20 W/m2 Blaulichtbestrahlung für 120 min erreicht. Wie in Abbildung 5A dargestellt, gibt es keinen signifikanten Unterschied (p-Wert = 0,20) in der Inaktivierungsrate für S. aureus bei Blaulichtbestrahlung mit 60 μM FMN bei 20 W/m2 für 120 min (Energiedosis 14,4 J/cm2) oder 120 μM FMN bei 20 W/m2 für 60 min (Energiedosis, 7,2 J/cm2). Andererseits wurden, wie in Abbildung 5B dargestellt, Inaktivierungsraten von 53 % bzw. 96 % für S. aureus ohne bzw. mit 30 μM FMN unter violetter Lichtbestrahlung bei 10 W/m2 für 30 min (Energiedosis von 1,8 J/cm2) erreicht. Daher hat FMN, das blauem oder violettem Licht ausgesetzt ist, einen größeren Einfluss auf die Lebensfähigkeit von S. aureus, indem es die bakterielle Inaktivierung erhöht. FMN, das mit violetter Lichtbestrahlung behandelt wird, ist bei der Inaktivierung von S. aureus effizienter.

Detektion von Equation 10 bei FMN-behandeltem S. aureus unter violetter Lichtbestrahlung
Die Produktion von Equation 1 FMN-behandeltem S. aureus unter violetter Bestrahlung wurde mit der NBT-Reduktionsmethode bestimmt. Der Extinktionswert bei 560 nm wurde verwendet, um den Umfang der Equation 1 Produktion zu bewerten. Die photochemische Wirkung von FMN auf Equation 1 die Bildung in S. aureus ist proportional zur FMN-Konzentration (Abbildung 6). Die 560 nm Extinktionswerte für S. aureus ohne FMN-Behandlung betragen 0,31 bzw. 0,07 unter 10 W/m2 violetter Lichtbestrahlung für 10 min bzw. im Dunkeln (Abbildung 6). Dies deutet darauf hin, dass bei unbehandeltem S. aureus nach violetter Bestrahlung wenig Equation 1 produziert wurde. Die jeweiligen 560 nm Extinktionswerte für S. aureus, die mit 100 μM FMN behandelt wurden, betragen 1,36 bzw. 0,08 unter 10 W/m2 violetter Lichtbestrahlung für 10 min bzw. im Dunkeln. Daher nimmt der photochemische Effekt auf die NBT-Reduktion bei FMN-behandeltem S. aureus unter violetter Bestrahlung zu, was Equation 1 reichlich produziert wird.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Photoreaktionssystems. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Emissionsspektren von blauen, grünen, roten und violetten LED-Leuchten in dieser Studie. Die Emissionsmaxima für das blaue, grüne, rote und violette Licht liegen bei 465, 529, 632 bzw. 405 nm, und die Spektralbreiten in halber Höhe (B1/2) betragen 26, 31, 14 bzw. 12 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Absorptionsspektren von FMN, behandelt mit LEDs verschiedener Wellenlängen bei 10 W/m2 für 5 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: NBT-Reduktion zur Bestimmung der Wirkung von blauer und violetter Lichtbestrahlung bei 10 W/m2 für 1-5 min auf die FMN-Photolyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Wirkung der FMN-Photolyse auf die Lebensfähigkeit von S. aureus. Die prozentuale Minderung ist definiert als negativer Wert der Inaktivierungsrate für S. aureus, das mit (A) FMN unter Blaulichtbestrahlung bei 20 W/m2 für 120 min und (B) FMN unter violetter Bestrahlung bei 10 W/m2 für 30 min behandelt wurde. Es ist zu beachten, dass es keinen signifikanten Unterschied (p = 0,20) in der Inaktivierungsrate für S. aureus bei 60 μM FMN bei 20 W/m 2 Blaulichtbestrahlung für 120 min oder 120 μM FMN bei 20 W/m2 Blaulichtbestrahlung für 60 min (A) gibt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, wobei n = 3 ist. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Einfluss der FMN-Konzentration auf die Equation 10 Bildung in S. aureus bei violetter Bestrahlung bei 10 W/m2 für 10 min. Insgesamt wird in S. aureus in Abwesenheit von FMN wenig Equation 1 produziert, obwohl die violette Lichtbestrahlung in der bestrahlten Probe (PB (violettes Licht)) im Vergleich zur Dunkelkontrolle (PB (Dark)) leicht zunimmtEquation 1. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, wobei n = 3 ist. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Ein Photosensibilisator erhöht die photochemische Reaktion chemischer Verbindungen, um ROS zu erzeugen. Pathogene Mikroorganismen können durch Lichtbestrahlung in Gegenwart von Photosensibilisatoren inaktiviert werden. Diese Studie bestimmt den aPDI von S. aureus aufgrund von ROS, das durch violette Lichtbestrahlung eines exogenen Photosensibilisators FMN erzeugt wird.

Wie in Abbildung 3 dargestellt, ist die Extinktion bei FMN bei 444 nm nach 5 Minuten Bestrahlung mit violettem oder blauem Licht signifikant reduziert, und es gibt keine signifikante Änderung der FMN-Absorption unter Bestrahlung mit grünem oder rotem Licht. Die NBT-Reduktion wird verwendet, um die Bildung von Equation 1über einen Ladungstransferprozess10,33 zu bestimmen. Eine frühere Studie der Autoren verwendete FMN unter Blau-, Grün- oder Rotlichtbestrahlung, um die Bildung der Equation 1 NBT-Reduktion zu bestimmen. Die Bestrahlung mit blauem Licht erzeugt eine enorme Menge an Equation 1 blauem Licht, während die photolytische Effizienz von grünem und rotem Licht weniger als 3% der von blauem Licht erreichten beträgt10. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Ladungstransferprozess erzeugt wird, wenn FMN blauer oder violetter Lichtbestrahlung ausgesetzt wird, und dass es keine signifikante Veränderung bei der Bestrahlung mit grünem oder rotem Licht gibt.

Eine frühere Studie der Autoren34 zeigte, dass der Mechanismus für die FMN-Photolyse mit primären FMN-photolytischen Reaktionen beschrieben werden kann (Gleichung 1):

Equation 2 (1),

wobei 1FMN* und 3FMN* die Singulett- bzw. Triplett-Zustände des angeregten FMN sind. Die photolytischen Reaktionsmechanismen für diese photoinduzierten FMN werden möglicherweise durch eine Triplett-Triplett-Annihilation oder einen Triplett-Grundzustandslöschprozessausgelöst 35,36,37,38. Der Grundzustand von FMN (FMN0) ist ein Elektronendonor, der ein Elektron zu 3FMN* liefert und die halbreduzierte (FMN•-) und halboxidierte (FMN•+) Form erzeugt, wie in Gleichung 2 gezeigt

Equation 3 (2)

Die Photoabbauwege für FMN resultieren aus der Photosensibilisierung. FMN wird durch eine photolytische Reaktion in den elektronisch angeregten Zustand FMN• befördert und dann wird ein neutrales FMN reduziert, wenn FMN• ein Elektron verliert, wie in den folgenden Gleichungen 3-8 gezeigt:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

wobei FMN•+ eine radikalische Kationenspezies ist.

Die Wechselwirkung von FMN•- mitO2 (3Σg-) erzeugt das reaktive Superoxid-RadikalEquation 1, gefolgt vom Hydroperoxyl-Rest HOO•, das bei der Reaktion zwischen Equation 1 und einem Proton entsteht und schließlich zum Abbau von FMN0 führt:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

wobei FMN•- ein radikales Anion ist.

In der vorliegenden Studie beträgt die Inaktivierungsrate bei S. aureus bei Abwesenheit von FMN 53% unter violetter Lichtbestrahlung bei 10 W/m2 für 30 min und 26% unter blauer Lichtbestrahlung bei 20 W/m2 für 120 min, was darauf hindeutet, dass Blaulichtbestrahlung weniger Bakterien deaktiviert als violettes Licht (Abbildung 5). Es wurde bereits berichtet, dass die Bestrahlung bei Wellenlängen von mehr als 430 nm ohne einen exogenen Photosensibilisator S. aureus-Zellen nicht inaktiviert, obwohl Porphyrine in S. aureus eine maximale Absorption bei 405 ± 5 nm aufweisen und nach der Bestrahlung eine bakterielle Inaktivierung verursachen39.

Eine frühere Studie der vorliegenden Autoren zeigte, dass E. coli und S. aureus durch DNA-Spaltung deaktiviert werden, die durch die Bildung von durch Photolyse von Riboflavin oder FMN10,24,40 induziert wird. Die jeweiligen Inaktivierungsraten für S. aureus betragen 97 % bzw. 96 % bei Verwendung von 120 μM FMN unter 20 W/m 2 Blaulichtbestrahlung (Energiedosis von 14,4 J/cm2) für 120 min und 30 μM FMN unter 10 W/m2 violetter Lichtbefeldung (Energiedosis von 1,8 J/cm2) für 30 min (Abbildung 5). Daher ist die violette Lichtbestrahlung bei der Deaktivierung von S. aureus wirksamer, da niederenergetische Dosen von violettem Licht S. aureus bei niedrigeren FMN-Konzentrationen und kürzeren Beleuchtungszeiten im Vergleich zu blauem Licht deaktivieren können. Obwohl das Ausmaß der FMN-Photolyse, die durch violettes Licht erreicht wird, im Vergleich zu blauem Licht höher ist (Abbildung 3), sind die durchschnittlichen photolytischen Effekte von FMN auf die NBT-Reduktion unter blauer und violetter Lichtbestrahlung ähnlich (Abbildung 4).

E. coli ist ein häufiges gramnegatives Bakterium. Riboflavin oder FMN-Photolyse durch Blaulichtbestrahlung inaktiviert E. coli über ROS 10,24,41 mit einer Inaktivierungsrate von 96% bei Verwendung von FMN10,24. S. aureus hingegen ist ein grampositives Bakterium, das durch FMN-Photolyse unter violetter Bestrahlung effektiv inaktiviert wird, wie hier gezeigt wird (Abbildung 5). Daher kann die photolytische FMN-Reaktion unter blauer oder violetter Bestrahlung ROS erzeugen und sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterien inaktivieren.

In Abwesenheit von FMN wird jedoch wenig Equation 1 in S. aureus produziert, das violetter Bestrahlung ausgesetzt ist (Abbildung 6); daher verringern endogene Photosensibilisatoren die Lebensfähigkeit von S. aureus unter violetter Bestrahlung nur geringfügig im Vergleich zu der Wirkung in Gegenwart von exogenen Photosensibilisatoren wie FMN. Unter den gleichen Bedingungen verringert FMN, das violetter Lichtbestrahlung ausgesetzt wird, die Lebensfähigkeit von S. aureus und führt zu einer Inaktivierungsrate von 96%, die viel höher ist als die von endogenen intrazellulären Photosensibilisatoren allein. Die Produktion von Equation 1 FMN-behandeltem S. aureus unter violetter Bestrahlung hat signifikant zugenommen, wie in Abbildung 6 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass FMN, wenn es violetter Lichtbestrahlung ausgesetzt wird, ein erhöhtes Maß an bakterieller Inaktivierung verursacht.

FMN kann einen photoangeregten Zustand erreichen, wenn es mit UV 1,2,21,22,23, blauem 10,24 und violettem Licht 31 bestrahlt wird; Die Zytotoxizität, die durch UV-Strahlung und hochintensive kurzwellige Bestrahlung hervorgerufen wird, muss jedoch berücksichtigt werden42. Auf der anderen Seite produzieren rote und grüne Strahlungen mit längeren Wellenlängen während der FMN-Photolyse10 keine signifikanten Mengen an ROS. Daher erfordert das ROS-induzierte aPDI von S. aureus die Bestrahlung von FMN mit violettem Licht, das eine mittlere Wellenlänge hat. Die spektrale Breite in halber Höhe (B1/2) für violettes Licht muss eng sein, um eine Überlappung mit der UV-Absorption zu vermeiden und das Risiko durch UV-Strahlungzu hemmen 31. Der Mikronährstoff FMN ist als solcher harmlos und ein essentielles Vitamin für den menschlichen Körper. Mit einem geeigneten Photosensibilisator wie FMN kann die energiearme violette Lichtbestrahlung pathogene Bakterien unterdrücken und ein sicheres und wirksames Mittel für den Hygieneprozess darstellen. Neben der photolytischen Reaktion von FMN auf S. aureus verdienen andere Fragen weitere Untersuchungen, wie z.B. die Phototoxizität von FMN auf Mikroben, die sich aus dem Stress durch ergeben, der durch Equation 1 untersucht werden kann.

Die FMN-Photolyse durch violette Bestrahlung führt zu einer photochemischen Oxidation, durch die ROS erzeugt wird und wiederum die Inaktivierung pathogener Bakterien verstärkt. Die Verwendung von violettem Licht gilt als kritischer Schritt bei der FMN-Photozerlegung. Die Einschränkung der aktuellen Technik besteht darin, dass das Wellenlängenintervall des violetten Lichts ziemlich eng sein muss, um das Risiko durch UV-Bestrahlung zu vermeiden. Die aktuelle Methode hat das Potenzial für zukünftige medizinische Anwendungen, wie z.B. die Behandlung von Infektionen der Oberflächenhaut zusammen mit tiefen Unterhautgeweben oder Muskeln durch Einführen einer optischen Faser, um das violette Licht auf die infizierten Bereiche zu lenken. Die photochemische Behandlung mit FMN ist daher eine sichere und einfache Möglichkeit, effektive Hygienepraktiken zu gewährleisten.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Tak-Wah Wong und Herrn Zong-Jhe Hsieh für ihre Unterstützung bei den Experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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Bioengineering Ausgabe 182 FMN Photolyse ROS S. aureus violettes Licht
Inaktivierung von Krankheitserregern <em>durch</em> Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht
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