תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים
Summary
פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.
Abstract
תרביות משותפות מורכבות של אורגנואידים עם תאי מערכת החיסון מספקות כלי רב-תכליתי לחקירת האינטראקציות הדו-כיווניות העומדות בבסיס האיזון העדין של הומאוסטזיס הרירי. מערכות תלת-ממדיות ורב-תאיות אלה מציעות מודל רדוקציוניסטי לטיפול במחלות רב-גורמיות ולפתרון קשיים טכניים המתעוררים בעת חקר סוגי תאים נדירים כגון תאי לימפה מולדים (ILCs) המתגוררים ברקמות. מאמר זה מתאר מערכת מורין המשלבת אורגנואידים של המעי הדק ו-ILCs מסוג 1 (ILC1s) שמקורם במעי הדק, אשר ניתן להרחיבם בקלות לאוכלוסיות ILC או חיסוניות אחרות. ILCs הם אוכלוסייה תושבת רקמות אשר מועשרת במיוחד ברירית, שם הם מקדמים הומאוסטזיס ומגיבים במהירות לנזק או לזיהום. תרביות אורגנואידיות משותפות עם ILCs כבר החלו לשפוך אור על מודולי איתות חדשים של אפיתל-חיסון במעיים, וחשפו כיצד תת-קבוצות ILC שונות משפיעות על שלמות והתחדשות מחסום אפיתל במעיים. פרוטוקול זה יאפשר חקירות נוספות של אינטראקציות הדדיות בין אפיתל לתאי מערכת החיסון, אשר טומנות בחובן פוטנציאל לספק תובנות חדשות על המנגנונים של הומאוסטזיס ודלקת רירית.
Introduction
התקשורת בין אפיתל המעיים לבין מערכת החיסון של המעיים היא מרכזית בשמירה על הומאוסטזיס של המעיים1. שיבושים באינטראקציות אלה קשורים למחלות מקומיות ומערכתיות כאחד, כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן במערכת העיכול2. דוגמה בולטת לרגולטור ביקורתי נוסף של הומאוסטזיס שתואר לאחרונה מגיעה ממחקר של תאי לימפה מולדים (ILCs), שהתגלו כשחקני מפתח בנוף החיסוני במעיים3. ILCs הם קבוצה של תאי חיסון מולדים הטרוגניים המווסתים הומאוסטזיס במעיים ומתזמרים דלקת בעיקר באמצעות איתות בתיווך ציטוקינים4.
ה-ILC של מורין מחולקים באופן נרחב לתת-סוגים המבוססים על פרופילי ביטוי של גורם שעתוק, קולטן וציטוקינים5. ILCs מסוג 1, הכוללים תאי הרג טבעי ציטוטוקסיים (NK) ו-ILCs דמויי עוזר מסוג 1 (ILC1s), מוגדרים על ידי ביטוי של גורם השעתוק (eomesodermin) Eomes וחלבון T-box המבוטא בתאי T (T-bet)6, בהתאמה, וציטוקינים מפרישים הקשורים לחסינות מסוג T עוזר סוג-1 (TH1): אינטרפרון-γ (IFNγ) וגורם נמק הגידול (TNF), בתגובה לאינטרלוקין (IL)-12, IL-15 ו- IL-187. במהלך הומאוסטזיס, ILC1s תושבי רקמות מפרישים β גורם גדילה משתנה (TGF-β) כדי להניע התפשטות אפיתל ושיפוץ מטריצה8. ILCs מסוג 2 (ILC2s) מגיבים בעיקר לזיהום הלמינת באמצעות הפרשה של ציטוקינים הקשורים ל-T helper Type-2 (TH2): IL-4, IL-5 ו-IL-13, והם מאופיינים בביטוי של קולטן יתום הקשור לחומצה רטינואית (ROR) α (ROR-α)9 וחלבון קושר GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . בעכברים, תאי ILC2 “דלקתיים” במעיים מאופיינים גם בביטוי של קולטן דמוי לקטין של תאי Killer (תת-משפחה של חבר G 1, KLRG)13 שבו הם מגיבים לתאי אפיתל שמקורם ב-IL-2514,15. לבסוף, ILC מסוג 3, הכוללים תאים משרי רקמות לימפואידיות ו-ILCs דמויי עוזר מסוג 3 (ILC3s), תלויים בפקטור השעתוק ROR-γt16, ומתקבצים לקבוצות המפרישות גורם מגרה מושבה מקרופאג’ גרנולוציטים (GM-CSF), IL-17 או IL-22 בתגובה לאותות IL-1β ו-IL-23 מקומיים17. תאים משרי רקמות לימפואידיות מתקבצים במדבקות של פייר והם חיוניים להתפתחותם של איברים לימפואידיים משניים אלה במהלך התפתחות18, בעוד ש- ILC3s הם תת-הסוג הנפוץ ביותר של ILC במעי הדק של מורין בוגר למינה פרופריה. אחת ממערכות התרבית המשותפת האורגנואידית המוקדמות ביותר במעי מורין עם ILC3s נרתמה כדי להקניט את ההשפעה של הציטוקינים IL-22 על מתמר האותות והמפעיל של שעתוק 3 (STAT-3) בתיווך Leucine-Rich Repeat המכיל קולטן מצומד לחלבון G 5 (Lgr5)+ התפשטות תאי גזעבמעיים 19, דוגמה רבת עוצמה לאינטראקציה רגנרטיבית של ILC-אפיתל. תאי ILCs מפגינים הטרוגניות חותם-הטרוגניות בין איברים20,21 ומפגינים פלסטיות בין תת-קבוצות בתגובה לקיטוב ציטוקינים22. מה שמניע את ההטבעות הספציפיות לרקמות ואת הבדלי הפלסטיות האלה, ואיזה תפקיד הם ממלאים במחלות כרוניות כמו IBD23, נותרו נושאים מרגשים שניתן לטפל בהם באמצעות תרביות אורגנואידיות משותפות.
אורגנואידים במעיים התגלו כמודל מוצלח ואמין לחקר אפיתל המעי24,25. אלה נוצרים על ידי culturing אפיתל מעיים Lgr5+ תאי גזע, או קריפטות מבודדות שלמות, הכוללות תאי Paneth כמקור אנדוגני של Wnt Family Member 3A (Wnt3a). מבנים תלת-ממדיים אלה מתוחזקים בהידרוג’לים סינתטיים26 או בביו-חומרים המחקים את הלמינה פרופריה הבסיסית, למשל, מטריצה חוץ-תאית בסיסית (TBEM) צולבת תרמית,ויש להם תוספת נוספת לגורמי גדילה המחקים את הנישה הסובבת אותה, ובראשם גורם הגדילה האפיתליאלי (EGF), מעכב החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP) נוג’ין, ו-Lgr5-ליגנד ו-Wnt-אגוניסט R-Spondin127 . בתנאים אלה, האורגנואידים שומרים על קוטביות אפיתל אפיתליאלית אפיתלית אפיתלית-בסיסית ומשחזרים את מבנה הקריפטה-וילי של אפיתל המעי עם קריפטות של תאי גזע ניצנים המתמיינים באופן סופני לתאים מחסלים ומפרישים במרכז האורגנואיד, אשר לאחר מכן משילים לתוך הפסאודולומן הפנימי על ידי אנוכיס28. אף על פי שאורגנואידים במעיים לבדם זכו ליתרון עצום כמודלים רדוקציוניסטיים של התפתחות אפיתל ודינמיקה בבידוד29,30, הם טומנים בחובם פוטנציאל עתידי עצום להבנת האופן שבו התנהגויות אלה מווסתות, מושפעות או אפילו מופרעות על ידי תא החיסון.
בפרוטוקול הבא מתוארת שיטה של תרבית משותפת בין אורגנואידים במעיים קטנים של מורין לבין ILC1s שמקורם בלמינה פרופריה, אשר שימשה לאחרונה כדי לזהות כיצד אוכלוסייה זו מפחיתה באופן בלתי צפוי את חתימות המעיים של דלקת ובמקום זאת תורמת להתרבות אפיתל מוגברת באמצעות TGF-β במערכת זו8.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השיטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד ILC1 נדיר על ידי מזעור אובדן לימפוציטים במהלך פרוטוקול דיסוציאציה במעיים, ויצירת תרביות משותפות בין שני תאים אלה. ישנם שלבים רבים לפרוטוקול זה, ובעוד שחלקם ספציפיים ל- ILC1s, ניתן ליישם גישה זו על סוגים אחרים של תאי חיסון …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
א.ר. מכיר במלגת דוקטור מטעם קרן Wellcome (215027/Z/18/Z). G.M.J. מכיר במלגת דוקטורט מקרן Wellcome (203757/Z/16/A). D.C. מכיר בתואר דוקטורנט מה-NIHR GSTT BRC. J.F.N. מכיר במלגת מארי סקלודובסקה-קירי, מלגת פרס קינגס, מלגת קרן רתרפורד של RCUK/UKRI (MR/R024812/1) ופרס זרעים במדע מטעם קרן Wellcome (204394/Z/16/Z). אנו מודים גם לצוות הליבה של ציטומטריית זרימת BRC שבסיסו בבית החולים גיא. עכברי הכתבים Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 היו מתנה נדיבה מ-G. Eberl (מכון פסטר, פריז, צרפת). עכברי CD45.1 C57BL/6 ניתנו בחביבות על ידי ט’ לורנס (קינגס קולג’ לונדון, לונדון) ופ’ בראל (קינגס קולג’ לונדון, לונדון).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
References
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
- Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
- Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
- Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
- Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
- Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
- Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
- Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
- Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
- Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
- Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
- Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
- Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
- Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
- Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
- Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
- Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
- Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
- Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).
