जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के साथ मुरीन छोटी आंत उपकला ऑर्गेनोइड्स की सह-संस्कृति
Summary
यह प्रोटोकॉल मुरीन छोटी आंत ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है, मूरीन छोटी आंत लामिना प्रोपरिया से टाइप -1 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को अलग करता है, और आंतों के उपकला कोशिकाओं और टाइप -1 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के बीच द्वि-दिशात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए दोनों सेल प्रकारों के बीच 3-आयामी (3 डी) सह-संस्कृतियों की स्थापना करता है।
Abstract
प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ ऑर्गेनोइड्स की जटिल सह-संस्कृतियां द्वि-दिशात्मक इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करती हैं जो म्यूकोसल होमियोस्टैसिस के नाजुक संतुलन को रेखांकित करती हैं। ये 3 डी, मल्टी-सेलुलर सिस्टम बहु-फैक्टोरियल बीमारियों को संबोधित करने और तकनीकी कठिनाइयों को हल करने के लिए एक रिडक्शनिस्ट मॉडल प्रदान करते हैं जो दुर्लभ सेल प्रकारों जैसे ऊतक-निवासी जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी) का अध्ययन करते समय उत्पन्न होती हैं। यह लेख एक मुरीन प्रणाली का वर्णन करता है जो छोटी आंत के ऑर्गेनोइड्स और छोटी आंत लामिना प्रोपरिया व्युत्पन्न सहायक-जैसे टाइप -1 आईएलसी (आईएलसी 1 एस) को जोड़ता है, जिसे आसानी से अन्य आईएलसी या प्रतिरक्षा आबादी तक बढ़ाया जा सकता है। आईएलसी एक ऊतक-निवासी आबादी है जो विशेष रूप से म्यूकोसा में समृद्ध है, जहां वे होमियोस्टैसिस को बढ़ावा देते हैं और तेजी से क्षति या संक्रमण का जवाब देते हैं। आईएलसी के साथ ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों ने पहले से ही आंत में नए उपकला-प्रतिरक्षा सिग्नलिंग मॉड्यूल पर प्रकाश डालना शुरू कर दिया है, जिससे पता चलता है कि विभिन्न आईएलसी सबसेट आंतों के उपकला बाधा अखंडता और उत्थान को कैसे प्रभावित करते हैं। यह प्रोटोकॉल उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच पारस्परिक बातचीत में आगे की जांच को सक्षम करेगा, जो म्यूकोसल होमोस्टैसिस और सूजन के तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता रखता है।
Introduction
आंतों के उपकला और आंत-निवासी प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच संचार आंतों के होमियोस्टैसिस1 के रखरखाव के लिए केंद्रीय है। इन इंटरैक्शन के लिए व्यवधान स्थानीय और प्रणालीगत दोनों बीमारियों से जुड़े हुए हैं, जिनमें सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) और जठरांत्र संबंधी कैंसर2 शामिल हैं। होमोस्टैसिस के हाल ही में वर्णित महत्वपूर्ण नियामक का एक उल्लेखनीय उदाहरण जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी) के अध्ययन से आता है, जो आंतों की प्रतिरक्षा परिदृश्य3 में प्रमुख खिलाड़ियों के रूप में उभरा है। आईएलसी हेटरोजेनस जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक समूह है जो आंतों के होमोस्टैसिस को विनियमित करता है और साइटोकाइन-मध्यस्थता सिग्नलिंग 4 के माध्यम से बड़े पैमाने पर सूजन को व्यवस्थित करताहै।
मुरीन आईएलसी को मोटे तौर पर प्रतिलेखन कारक, रिसेप्टर और साइटोकाइन अभिव्यक्ति प्रोफाइल5 के आधार पर उपप्रकारों में विभाजित किया गया है। टाइप -1 आईएलसी, जिसमें साइटोटॉक्सिक नेचुरल किलर (एनके) कोशिकाएं और सहायक-जैसे टाइप -1 आईएलसी (आईएलसी 1 एस) शामिल हैं, को प्रतिलेखन कारक (इओमेसोडर्मिन) इओम्स और टी-बॉक्स प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया है, जो क्रमशः टी कोशिकाओं (टी-बेट) 6 में व्यक्त किया गया है, और टी हेल्पर टाइप -1 (टीएच1) प्रतिरक्षा से जुड़े साइटोकिन्स को स्रावित करता है: इंटरफेरॉन-γ (आईएफएन) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ), इंटरल्यूकिन (आईएल) के जवाब में, इंटरफेरॉन-γ (आईएफएन) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ), इंटरल्यूकिन (आईएल) के जवाब में। आईएल -15 और आईएल -187। होमियोस्टैसिस के दौरान, ऊतक-निवासी आईएलसी 1 एस उपकला प्रसार और मैट्रिक्स रीमॉडलिंग 8 को चलाने के लिए ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर β (टीजीएफ-β) का स्राव करताहै। टाइप -2 आईएलसी (आईएलसी 2 एस) मुख्य रूप से टी हेल्पर टाइप -2 (टीएच2) संबंधित साइटोकिन्स के स्राव के माध्यम से हेल्मिंथ संक्रमण का जवाब देते हैं: आईएल -4, आईएल -5, और आईएल -13, और रेटिनोइक एसिड से संबंधित अनाथ रिसेप्टर (आरओआर) α (आरओआर -α)9 और गाटा बाइंडिंग प्रोटीन 3 (जीएटीए -3) 10,11,12 की अभिव्यक्ति की विशेषता है। . चूहों में, आंतों के “भड़काऊ” आईएलसी 2 एस को किलर सेल लेक्टिन-जैसे रिसेप्टर (उपपरिवार जी सदस्य 1, केएलआरजी) 13 की अभिव्यक्ति की विशेषता है जहां वे उपकला टफ्ट-सेल व्युत्पन्न आईएल -2514,15 का जवाब देते हैं। अंत में, टाइप -3 आईएलसी, जिसमें लिम्फोइड ऊतक प्रेरक कोशिकाएं और सहायक-जैसे टाइप -3 आईएलसी (आईएलसी 3) शामिल हैं, प्रतिलेखन कारकआरओआर-16 पर निर्भर हैं, और समूहों में क्लस्टर हैं जो स्थानीय आईएल -1 और आईएल -23 सिग्नल17 के जवाब में ग्रैनुलोसाइट्स मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), आईएल -17, या आईएल -22 को स्रावित करते हैं। लिम्फोइड ऊतक प्रेरक कोशिकाएं पियर्स के पैच में क्लस्टर होती हैं और विकास18 के दौरान इन माध्यमिक लिम्फोइड अंगों के विकास के लिए महत्वपूर्ण होती हैं, जबकि आईएलसी 3 एस वयस्क मुरीन छोटी आंत लामिना प्रोपरिया में सबसे प्रचुर मात्रा में आईएलसी उपप्रकार हैं। आईएलसी 3 के साथ शुरुआती मुरीन आंतों के ऑर्गेनोइड सह-संस्कृति प्रणालियों में से एक का उपयोग सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 (स्टेट -3) के एक्टिवेटर पर साइटोकाइन आईएल -22 के प्रभाव को अलग करने के लिए किया गया था मध्यस्थता ल्यूसीन-रिच दोहराने में जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 5 (एलजीआर 5) + आंतों के स्टेम सेल प्रसार19, एक पुनर्योजी आईएलसी-उपकला बातचीत का एक शक्तिशाली उदाहरण। आईएलसीअंगों 20,21 के बीच छाप-विषमता प्रदर्शित करते हैं और ध्रुवीकरण साइटोकिन्स22 के जवाब में सबसेट के बीच प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करते हैं। इन ऊतक-विशिष्ट छापों और प्लास्टिसिटी मतभेदों को क्या चलाता है, और आईबीडी23 जैसी पुरानी बीमारियों में वे क्या भूमिका निभाते हैं, रोमांचक विषय बने हुए हैं जिन्हें ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है।
आंतों के ऑर्गेनोइड्स आंतों के उपकला24,25 का अध्ययन करने के लिए एक सफल और विश्वसनीय मॉडल के रूप में उभरे हैं। ये आंतों के उपकला Lgr5 + स्टेम कोशिकाओं, या पूरे अलग crypts, जो WNT परिवार के सदस्य 3A (WNT3a) के एक अंतर्जात स्रोत के रूप में पनेथ कोशिकाओं को शामिल करने के द्वारा उत्पन्न होते हैं। इन 3 डी संरचनाओं को या तो सिंथेटिक हाइड्रोजेल26 में या बायोमैटेरियल्स में बनाए रखा जाता है जो बेसल लामिना प्रोपरिया की नकल करते हैं, उदाहरण के लिए, थर्मल-क्रॉसलिंकिंग बेसल एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (टीबीईएम), और आगे विकास कारकों के साथ पूरक होते हैं जो आसपास के आला की नकल करते हैं, सबसे विशेष रूप से उपकला विकास कारक (ईजीएफ), बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) -अवरोधक नोगिन, और एक Lgr5-लिगैंड और WNT-एगोनिस्ट R-Spondin127 . इन शर्तों के तहत, ऑर्गेनोइड्स उपकला एपिको-बेसल ध्रुवीयता को बनाए रखते हैं और नवोदित स्टेम सेल क्रिप्ट्स के साथ आंतों के उपकला की क्रिप्ट-विली संरचना को दोहराते हैं जो ऑर्गेनोइड के केंद्र में अवशोषक और स्रावी कोशिकाओं में अंतर करते हैं, जो तब एनोइकिस28 द्वारा आंतरिक स्यूडोलुमेन में बहाते हैं। यद्यपि अकेले आंत्र ऑर्गेनोइड्स29,30 अलगाव में उपकला विकास और गतिशीलता के न्यूनीकरणवादी मॉडल के रूप में बेहद फायदेमंद रहे हैं, वे यह समझने के लिए जबरदस्त भविष्य की क्षमता रखते हैं कि इन व्यवहारों को कैसे विनियमित किया जाता है, प्रभावित किया जाता है, या यहां तक कि प्रतिरक्षा डिब्बे द्वारा बाधित किया जाता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, मुरीन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स और लामिना प्रोपरिया व्युत्पन्न आईएलसी 1 एस के बीच सह-संस्कृति की एक विधि का वर्णन किया गया है, जिसका उपयोग हाल ही में यह पहचानने के लिए किया गया था कि यह आबादी अप्रत्याशित रूप से सूजन के आंतों के हस्ताक्षर को कैसे कम करती है और इसके बजाय इस प्रणाली में टीजीएफ-β के माध्यम से उपकला प्रसार में वृद्धि में योगदान देतीहै।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल म्यूरीन छोटी आंत ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के तरीकों का वर्णन करता है, आंतों के पृथक्करण प्रोटोकॉल के दौरान लिम्फोसाइट्स के नुकसान को कम करके दुर्लभ आईएलसी 1 को अलग करता है, और इन दो डिब्बों क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R. Wellcome Trust (215027/ Z/18/Z) से पीएचडी फैलोशिप को स्वीकार करता है। G.M.J. Wellcome Trust (203757/ Z/16/A) से पीएचडी फैलोशिप को स्वीकार करता है। डीसी NIHR GSTT BRC से पीएचडी studentship स्वीकार करता है। J.F.N. एक मैरी Skóodowska-Curie फैलोशिप, एक राजा के पुरस्कार फैलोशिप, एक RCUK / UKRI रदरफोर्ड फंड फैलोशिप (MR / R024812 / 1), और वेलकम ट्रस्ट (204394 / Z / 16 / Z) से विज्ञान में एक बीज पुरस्कार स्वीकार करता है। हम गाय के अस्पताल में स्थित बीआरसी फ्लो साइटोमेट्री कोर टीम को भी धन्यवाद देते हैं। Rorc (πt) – GfpTG C57BL / 6 रिपोर्टर चूहों जी Eberl (Institute Pasteur, पेरिस, फ्रांस) से एक उदार उपहार थे। CD45.1 C57BL/6 चूहों को कृपया टी लॉरेंस (किंग्स कॉलेज लंदन, लंदन) और पी. बैरल (किंग्स कॉलेज लंदन, लंदन) द्वारा दिया गया था।
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
References
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