Detta protokoll erbjuder detaljerade instruktioner för att upprätta murina tunntarmsorganoider, isolera typ 1 medfödda lymfoida celler från den murina tunntarmen lamina propria och etablera 3-dimensionella (3D) samkulturer mellan båda celltyperna för att studera dubbelriktade interaktioner mellan tarmepitelceller och typ 1 medfödda lymfoida celler.
Komplexa samkulturer av organoider med immunceller ger ett mångsidigt verktyg för att förhöra de dubbelriktade interaktionerna som ligger till grund för den känsliga balansen mellan slemhinnehomeostas. Dessa 3D, multicellulära system erbjuder en reduktionistisk modell för att ta itu med multifaktoriella sjukdomar och lösa tekniska svårigheter som uppstår när man studerar sällsynta celltyper som vävnadsboende medfödda lymfoida celler (ILC). Denna artikel beskriver ett murint system som kombinerar tunntarmsorganoider och tunntarm lamina propria härledda hjälparliknande typ-1 ILC (ILC1s), som lätt kan utvidgas till andra ILC- eller immunpopulationer. ILC är en vävnadsbosatt befolkning som är särskilt berikad i slemhinnan, där de främjar homeostas och snabbt svarar på skador eller infektioner. Organoida samkulturer med ILC har redan börjat belysa nya epitel-immuna signalmoduler i tarmen, vilket avslöjar hur olika ILC-delmängder påverkar tarmepitelbarriärens integritet och regenerering. Detta protokoll kommer att möjliggöra ytterligare undersökningar av ömsesidiga interaktioner mellan epitel- och immunceller, som har potential att ge nya insikter i mekanismerna för slemhinnehomeostas och inflammation.
Kommunikation mellan tarmepitelet och tarmens immunsystem är centralt för upprätthållandet av intestinal homeostas1. Störningar i dessa interaktioner är förknippade med både lokala och systemiska sjukdomar, inklusive inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och gastrointestinal cancer2. Ett anmärkningsvärt exempel på en mer nyligen beskriven kritisk regulator av homeostas kommer från studien av medfödda lymfoida celler (ILC), som har framträtt som nyckelaktörer i tarmimmunlandskapet3. ILC är en grupp heterogena medfödda immunceller som reglerar intestinal homeostas och orkestrerar inflammation till stor del genom cytokinmedierad signalering4.
Murin ILC är i stort sett indelade i subtyper baserade på transkriptionsfaktor-, receptor- och cytokinuttrycksprofiler5. Typ 1 ILC, som inkluderar cytotoxiska Natural Killer (NK) -celler och hjälparliknande typ 1 ILC (ILC1s), definieras genom uttryck av transkriptionsfaktorn (eomesodermin) Eomes och T-boxprotein uttryckt i T-celler (T-bet)6, respektive utsöndrar cytokiner associerade med T-hjälpare typ-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) och tumörnekrosfaktor (TNF), som svar på interleukin (IL)-12, IL-15 och IL-187. Under homeostas utsöndrar vävnadsinvånade ILC1:er Transforming Growth Factor β (TGF-β) för att driva epitelproliferation och matrisremodellering8. Typ 2 ILC(2) svarar främst på helminthinfektion via utsöndring av T-hjälpare typ-2 (TH2) associerade cytokiner: IL-4, IL-5 och IL-13, och kännetecknas av uttrycket av retinsyrarelaterad orphan receptor (ROR) α (ROR-α)9 och GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos möss kännetecknas intestinala “inflammatoriska” ILC2s vidare av uttryck av Killer cell lectin-liknande receptor (underfamilj G-medlem 1, KLRG)13 där de svarar på epitelial tuft-cell härledd IL-2514,15. Slutligen är typ 3 ILC, som inkluderar lymfoida vävnadsinducerarceller och hjälparliknande typ-3 ILC (ILC3s), beroende av transkriptionsfaktorn ROR-γt16 och kluster i grupper som utsöndrar antingen granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som svar på lokala IL-1β- och IL-23-signaler17. Lymfoida vävnadsinduceringsceller kluster i Peyers plåster och är avgörande för utvecklingen av dessa sekundära lymfoida organ under utveckling18, medan ILC3 är den vanligaste ILC-subtypen i den vuxna murina tunntarmen lamina propria. Ett av de tidigaste murina intestinala organoida samodlingssystemen med ILC3 utnyttjades för att reta isär effekten av cytokinet IL-22 på signalgivare och aktivator av transkription 3 (STAT-3) medierad leucinrik upprepning innehållande G-protein kopplad receptor 5 (Lgr5) + intestinal stamcellsproliferation19, ett kraftfullt exempel på en regenerativ ILC-epitelinteraktion. ILC uppvisar imprint-heterogenitet mellan organ 20,21 och uppvisar plasticitet mellan delmängder som svar på polariserande cytokiner22. Vad som driver dessa vävnadsspecifika avtryck och plasticitetsskillnader, och vilken roll de spelar i kroniska sjukdomar som IBD23, är fortfarande spännande ämnen som kan hanteras med hjälp av organoida samkulturer.
Tarmorganoider har framträtt som en framgångsrik och pålitlig modell för att studera tarmepitelet24,25. Dessa genereras genom odling av intestinala epiteliala Lgr5 + stamceller, eller hela isolerade krypter, som inkluderar Paneth-celler som en endogen källa till Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Dessa 3D-strukturer upprätthålls antingen i syntetiska hydrogeler26 eller i biomaterial som efterliknar den basala lamina propria, till exempel Termisk tvärbindning Basal Extracellular Matrix (TBEM), och kompletteras ytterligare med tillväxtfaktorer som efterliknar den omgivande nischen, framför allt Epitelial Growth Factor (EGF), Bone Morphogenetic Protein (BMP)-hämmaren Noggin och en Lgr5-ligand och Wnt-agonist R-Spondin127 . Under dessa förhållanden upprätthåller organoider epitelial apico-basal polaritet och rekapitulerar krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirande stamcellskrypter som terminalt differentieras till absorberande och sekretoriska celler i mitten av organoiden, som sedan kasta in i den inre pseudolumen med anoikis28. Även om tarmorganoider ensamma har varit enormt fördelaktiga som reduktionistiska modeller av epitelutveckling och dynamik isolerat 29,30, har de en enorm framtida potential för att förstå hur dessa beteenden regleras, påverkas eller till och med störs av immunfacket.
I följande protokoll beskrivs en metod för samodling mellan murina tunntarmsorganoider och lamina propria härledda ILC1s, som nyligen användes för att identifiera hur denna population oväntat minskar tarmsignaturerna av inflammation och istället bidrar till ökad epitelproliferation via TGF-β i detta system8.
Detta protokoll beskriver metoderna för att etablera murina tunntarmsorganoider, isolera sällsynta ILC1 genom att minimera förlusten av lymfocyter under tarmdissociationsprotokollet och etablera samkulturer mellan dessa två fack. Det finns många steg i detta protokoll, och medan vissa är specifika för ILC1, kan detta tillvägagångssätt tillämpas på andra intestinala immuncellstyper, och samodlingsinställningar kan anpassas modulärt för att passa enskilda forskningsfrågor. Flera kritiska steg (som rekommend…
The authors have nothing to disclose.
E.R. erkänner ett Ph.D. stipendium från Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. erkänner ett Ph.D. stipendium från Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). DC erkänner en doktorsexamen från NIHR GSTT BRC. J.F.N. erkänner ett Marie Skłodowska-Curie Fellowship, ett King’s Prize-stipendium, ett RCUK/UKRI Rutherford Fund-stipendium (MR/R024812/1) och ett Seed Award in Science från Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi tackar också BRC-flödescytometrikärnteamet baserat på Guy’s Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermöss var en generös gåva från G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrike). CD45.1 C57BL/6 möss gavs vänligt av T. Lawrence (King’s College London, London) och P. Barral (King’s College London, London).
Reagents | |||
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
Percoll | Cytiva | 17089101 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
Plastics | |||
50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
Ice box | – | – | |
Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
Wet ice | – | – |