Evaluación de la oxidación del sustrato energético in vitro con 14capturas de CO2
Summary
Este protocolo describe un método fácil de usar para examinar la oxidación del sustrato mediante el seguimiento de la producción de 14CO2 in vitro.
Abstract
Las mitocondrias albergan la maquinaria para el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la cadena de transporte de electrones (ETC), que generan trifosfato de adenosina (ATP) para mantener la homeostasis energética. La glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos son los principales sustratos energéticos que alimentan la respiración mitocondrial en la mayoría de las células somáticas. La evidencia muestra que los diferentes tipos de células pueden tener una clara preferencia por ciertos sustratos. Sin embargo, la utilización del sustrato por varias células en el esqueleto no se ha estudiado en detalle. Además, como el metabolismo celular está en sintonía con los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, las evaluaciones directas de la dependencia del sustrato en las células esqueléticas pueden proporcionar información importante sobre la patogénesis de las enfermedades óseas.
El siguiente protocolo se basa en el principio de liberación de dióxido de carbono de las moléculas de sustrato después de la fosforilación oxidativa. Mediante el uso de sustratos que contienen átomos de carbono marcados radiactivamente (14C), el método proporciona un ensayo sensible y fácil de usar para la tasa de oxidación del sustrato en el cultivo celular. Un estudio de caso con preosteoblastos calvariales primarios versus macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) demuestra una diferente utilización de los sustratos principales entre los dos tipos de células.
Introduction
La fosforilación oxidativa (OXPHOS) en eucariotas es el proceso por el cual los nutrientes se descomponen dentro de las mitocondrias para liberar energía química en forma de ATP a través del consumo de oxígeno. El catabolismo de varios sustratos dentro de las mitocondrias a través del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) genera pocas moléculas de ATP directamente, pero más bien almacena energía a través de la reducción de los portadores de electrones nicotinamida adenina dinucleótido (NAD +) y flavina adenina dinucleótido (FAD +). Los portadores reducidos son oxidados por ETC ubicado en la membrana interna de las mitocondrias para generar un gradiente de concentración de protones a través de la membrana. Los protones eventualmente fluyen por su gradiente de regreso a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa para producir ATP. OXPHOS es el medio más eficiente de producción de ATP a partir de sustratos energéticos y generalmente se prefiere en entornos aeróbicos. Anteriormente, se pensaba que la glucólisis aeróbica (producción de lactato a partir de glucosa mientras el oxígeno está presente) era fisiopatológica, a menudo un sello distintivo de las células cancerosas. Cada vez más, se está descubriendo que algunos tipos de células normales utilizan la glucólisis aeróbica por razones que aún no se han descifrado por completo.
La flexibilidad metabólica es la capacidad de las células u organismos para adaptarse a las cambiantes demandas de energía y las fuentes de combustible disponibles. Por ejemplo, la demanda energética del músculo esquelético es satisfecha principalmente por OXPHOS en estado estacionario, pero por glucólisis anaeróbica durante el ejercicio de alta intensidad1. A medida que aumenta la duración del ejercicio, la glucosa y la oxidación de ácidos grasos contribuyen más a la producción general de energía2. Sin embargo, el uso del sustrato no depende solo de la disponibilidad, ya que los sustratos compiten antagónicamente durante la oxidación. En particular, se ha demostrado que la oxidación de ácidos grasos inhibe la utilización de glucosa por el músculo esquelético en un fenómeno conocido como el efecto Randle3. Un efecto recíproco fue demostrado por estudios posteriores 4,5. Además, muchas enfermedades se asocian con un cambio en la preferencia de sustrato y el desarrollo de inflexibilidad metabólica en las células. Por ejemplo, la oxidación de ácidos grasos se reduce en el músculo esquelético de los pacientes diabéticos tipo II en comparación con los sujetos de control normales6. Los cambios metabólicos en los entornos de la enfermedad son objeto de una intensa investigación, ya que pueden contribuir a la patogénesis.
El metabolismo energético en los tipos de células esqueléticas está relativamente poco estudiado, pero ha ganado atención en los últimos años7. Trabajos previos han demostrado que la glucólisis aeróbica es la vía de energía dominante en los osteoblastos calvariales, mientras que la oxidación de la glucosa a través del ciclo TCA juega un papel en la formación de osteoclastos 8,9. Otros han proporcionado evidencia de ácidos grasos como fuente de energía para los osteoblastos10. También se ha demostrado que el catabolismo de glutamina apoya la diferenciación osteoblástica de los progenitores11,12. Sin embargo, todavía falta una comprensión integral de la utilización del sustrato por varios tipos de células esqueléticas. Además, se espera que los cambios en el metabolismo celular durante la diferenciación celular o en respuesta a señales patológicas alteren la utilización del sustrato de combustible. A continuación se describe un protocolo fácil de usar para evaluar la oxidación del sustrato in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo proporciona un método fácil de usar para determinar la tasa de oxidación de los principales sustratos energéticos. Es una alternativa más sencilla a otros protocolos que utilizan matraces que contienen un pozo central y están tapados con tapones de goma 14,15,16. Aunque el estudio de ejemplo aquí se realiza con cultivo celular, el método se puede adaptar fácilmente para explantes de tejido u homogeneizados …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado en parte por la subvención R01 AR060456 (FL) de los NIH. Agradecemos al Dr. Michael Robinson y Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) por su generosa ayuda con el mostrador de centelleo.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
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