Summary

Enerji Substrat Oksidasyonunun In Vitro 14CO2 Trapping ile Değerlendirilmesi

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Bu protokol, in vitro 14CO2 üretimini izleyerek substrat oksidasyonunu incelemek için kullanımı kolay bir yöntemi açıklar.

Abstract

Mitokondri, enerji homeostazını korumak için adenozin trifosfat (ATP) üreten trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve elektron taşıma zinciri (ETC) için makinelere ev sahipliği yapar. Glikoz, yağ asitleri ve amino asitler, çoğu somatik hücrede mitokondriyal solunumu besleyen başlıca enerji substratlarıdır. Kanıtlar, farklı hücre tiplerinin belirli substratlar için farklı bir tercihe sahip olabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, iskeletteki çeşitli hücreler tarafından substrat kullanımı ayrıntılı olarak çalışılmamıştır. Ayrıca, hücresel metabolizma fizyolojik ve patofizyolojik değişikliklere uyum sağladığından, iskelet hücrelerinde substrat bağımlılığının doğrudan değerlendirilmesi, kemik hastalıklarının patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Aşağıdaki protokol, oksidatif fosforilasyonu takiben substrat moleküllerinden karbondioksit salınımı prensibine dayanmaktadır. Radyoaktif olarak etiketlenmiş karbon atomları (14C) içeren substratları kullanarak, yöntem hücre kültüründeki substrat oksidasyon oranı için hassas ve kullanımı kolay bir test sağlar. Primer kalvarial preosteoblastlara karşı kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM’ler) ile yapılan bir vaka çalışması, iki hücre tipi arasındaki ana substratların farklı kullanımlarını göstermektedir.

Introduction

Ökaryotlardaki oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), oksijen tüketimi yoluyla ATP şeklinde kimyasal enerjiyi serbest bırakmak için besinlerin mitokondri içinde parçalandığı işlemdir.  Trikarboksilik asit (TCA) döngüsü yoluyla mitokondri içindeki çeşitli substratların katabolizması doğrudan az sayıda ATP molekülü üretir, ancak elektron taşıyıcıları nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +) ve flavin adenin dinükleotidin (FAD +) indirgenmesi yoluyla enerji depolar. İndirgenmiş taşıyıcılar daha sonra membran boyunca bir proton konsantrasyon gradyanı oluşturmak için mitokondrinin iç zarında bulunan ETC tarafından oksitlenir. Protonlar sonunda ATP üretmek için gradyanlarını ATP sentaz yoluyla mitokondriyal matrise geri akarlar. OXPHOS, enerji substratlarından ATP üretiminin en verimli aracıdır ve genellikle aerobik ortamlarda tercih edilir. Önceden, aerobik glikolizin – oksijen mevcutken glikozdan laktat üretimi – patofizyolojik olduğu, genellikle kanser hücrelerinin bir işareti olduğu düşünülüyordu. Giderek daha fazla, bazı normal hücre tiplerinin henüz tam olarak deşifre edilmemiş nedenlerden dolayı aerobik glikoliz kullandığı keşfedilmektedir.

Metabolik esneklik, hücrelerin veya organizmaların değişen enerji taleplerine ve mevcut yakıt kaynaklarına uyum sağlama kapasitesidir. Örneğin, iskelet kasının enerjik talebi esas olarak sabit durumda OXPHOS tarafından karşılanır, ancak yüksek yoğunluklu egzersiz sırasında anaerobik glikoliz1. Egzersiz süresi arttıkça, glikoz ve yağ asidi oksidasyonu genel enerji üretimine daha fazla katkıda bulunur2. Bununla birlikte, substrat kullanımı sadece kullanılabilirliğe bağlı değildir, çünkü substratlar oksidasyon sırasında antagonistik olarak rekabet eder. En önemlisi, yağ asidi oksidasyonunun, Randle etkisi3 olarak bilinen bir fenomende iskelet kası tarafından glikoz kullanımını inhibe ettiği gösterilmiştir. Karşılıklı bir etki sonraki çalışmalarla gösterilmiştir 4,5. Ek olarak, birçok hastalık substrat tercihindeki bir değişiklik ve hücrelerde metabolik esnekliğin gelişmesi ile ilişkilidir. Örneğin, tip II diyabetik hastaların iskelet kasında yağ asidi oksidasyonu normal kontrol deneklerine kıyasla azalır6. Hastalık ortamlarındaki metabolik değişiklikler patogeneze katkıda bulunabileceği için yoğun bir araştırma konusudur.

İskelet hücre tiplerinde enerji metabolizması nispeten az çalışılmakla birlikte son yıllarda dikkat çekmektedir7. Önceki çalışmalar, aerobik glikolizin kalvarial osteoblastlarda baskın enerji yolu olduğunu, TCA döngüsü boyunca glikoz oksidasyonunun osteoklast oluşumunda rol oynadığını göstermiştir 8,9. Diğerleri, osteoblastlar için bir enerji kaynağı olarak yağ asitleri için kanıt sağlamıştır10. Glutamin katabolizmasının da osteoblast farklılaşmasını progenitörlerden11,12 desteklediği gösterilmiştir. Bununla birlikte, çeşitli iskelet hücresi tipleri tarafından substrat kullanımının kapsamlı bir şekilde anlaşılması hala eksiktir. Ek olarak, hücre farklılaşması sırasında veya patolojik sinyallere yanıt olarak hücresel metabolizmadaki değişikliklerin yakıt substrat kullanımını değiştirmesi beklenir. Aşağıda açıklanan, in vitro substrat oksidasyonunu test etmek için kullanımı kolay bir protokoldür.

Protocol

Radyoaktif malzemelerin (RAM) kullanımı, her kurumda belirlenmiş bir güvenlik komitesi tarafından önceden onay alınmasını gerektirir. Bu protokolde kullanılan RAM’ler, Pennsylvania Üniversitesi’ndeki Çevre Sağlığı ve Radyasyon Güvenliği (EHRS) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların kullanımı, ev kurumundaki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından önceden onay alınmasını gerektirir. Aşağıdaki çalışma IACUC tarafından Philadelphia Çocuk Hastanesi’nde onaylanmış…

Representative Results

Bu örnekte, CO2 yakalama yöntemi, sırasıyla in vitro osteoblast veya osteoklast farklılaşması için sıklıkla kullanılan primer kalvarial preosteoblastlar ile BMM’ler arasındaki substrat oksidasyonunu karşılaştırmak için kullanılmıştır. Birincil hücreler bir gecede cMEMa’da paslanıp kültürlendikten sonra, tipik olarak birleşmenin% 80-90’ına ulaşırlar ve karakteristik morfolojilerini sergilerler. Kalvarial preosteoblastlar BMM’lerden önemli ölçüde daha büyüktür (<stron…

Discussion

Protokol, ana enerji substratlarının oksidasyon oranını belirlemek için kullanımı kolay bir yöntem sağlar. Merkezi bir kuyu içeren ve14,15,16 kauçuk tıpalarla kaplı şişeler kullanan diğer protokollere daha basit bir alternatiftir. Buradaki örnek çalışma hücre kültürü ile yapılmasına rağmen, yöntem daha önce tarif edildiği gibi doku eksplantları veya bozulmamış mitokondri içeren doku homojenatlar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma kısmen NIH hibe R01 AR060456 (FL) tarafından desteklenmiştir. Dr. Michael Robinson ve Elizabeth Krizman’a (Philadelphia Çocuk Hastanesi) parıltı sayacı konusundaki cömert yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

0.22 µm filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056 Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes PR1MA PR MCT17 RB Used for reaction incubation
10 cm plates TPP 93100 Used for cell culture
10 mL syringe BD 302995 Used to flush marrow from long bones
10% FBS Atlanta biologicals S11550 For Cell culture medium preparation
14C-Glucose PerkinElmer NEC042X050UC Used to make hot media
14C-glutamine PerkinElmer NEC451050UC Used to make hot media
14C-oleate PerkinElmer NEC317050UC Used to make hot media
23 G needle BD 305120 Used to flush marrow from long bones
24-well plates TPP 92024 Used for cell culture
70 μm cell strainers MIDSCI 70CELL Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye Nexcelom Biosciences CS2-0106 Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin Proliant Biologicals 68700 Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000 Nexcelom Biosciences Determine the number of viable cells
Centrifuge Thermo Fisher Legend Micro 21R Used to pellet cells
Collagenase type II Worthington LS004176 Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha GIBCO SKU: ME 18459P1 Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 10010023 Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper Millipore-Sigma WHA1001090 Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose Sigma-Aldrich g7528 Used to make custom media
HEPES Gibco 15630080 Traps CO2 during cell culture
L-carnitine Sigma-Aldrich C0283 Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine Sigma-Aldrich g3126 Used to make custom media
MEM alpha Thermo A10490 Cell culture medium
Parafilm Pecheney Plastic Packaging PM998 Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122 Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid Sigma-Aldrich 244252 Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate Sigma-Aldrich p5280 Used to make custom media
Scintillation Counter Beckman Coulter LS6500 Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid MP Biomedicals 882453 Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial Fisher Scientific 03-337-1 Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S5761 Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 58045 Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate SANTA CRUZ SC-215879 BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000 TPP 99950 Filter cMEMα

References

  1. Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
  2. Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
  3. Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
  4. Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
  5. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
  6. Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
  7. Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
  8. Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
  9. Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
  10. Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
  11. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  12. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  13. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  14. Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
  15. Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
  16. Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
  17. Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
  18. Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
  19. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).

Play Video

Cite This Article
Song, C., Valeri, A., Long, F. Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping. J. Vis. Exp. (181), e63568, doi:10.3791/63568 (2022).

View Video