Bedömning av energisubstratoxidation in vitro med 14CO 2-infångning
Summary
Detta protokoll beskriver en lättanvänd metod för att undersöka substratoxidation genom att spåra 14CO2-produktion in vitro.
Abstract
Mitokondrier är värd för maskineriet för trikarboxylsyracykeln (TCA) och elektrontransportkedjan (ETC), som genererar adenosintrifosfat (ATP) för att upprätthålla energihomeostas. Glukos, fettsyror och aminosyror är de viktigaste energisubstraten som driver mitokondriell andning i de flesta somatiska celler. Bevis visar att olika celltyper kan ha en distinkt preferens för vissa substrat. Substratutnyttjandet av olika celler i skelettet har dock inte studerats i detalj. Dessutom, eftersom cellulär metabolism är anpassad till fysiologiska och patofysiologiska förändringar, kan direkta bedömningar av substratberoende i skelettceller ge viktiga insikter i patogenesen av bensjukdomar.
Följande protokoll är baserat på principen om koldioxidfrisättning från substratmolekyler efter oxidativ fosforylering. Genom att använda substrat som innehåller radioaktivt märkta kolatomer (14C) ger metoden en känslig och lättanvänd analys för hastigheten för substratoxidation i cellodling. En fallstudie med primära kalvariska preosteoblaster kontra benmärgs-härledda makrofager (BMM) visar olika utnyttjande av huvudsubstraten mellan de två celltyperna.
Introduction
Oxidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter är den process genom vilken näringsämnen bryts ner inuti mitokondrier för att frigöra kemisk energi i form av ATP genom konsumtion av syre. Katabolism av olika substrat inuti mitokondrier genom trikarboxylsyracykeln (TCA) genererar få ATP-molekyler direkt, utan lagrar snarare energi genom reduktion av elektronbärarna nikotinamidadenindinukleotid (NAD +) och flavindeenindinukleotid (FAD +). De reducerade bärarna oxideras sedan av ETC som ligger på mitokondriernas inre membran för att generera en protonkoncentrationsgradient över membranet. Protonerna strömmar så småningom ner i sin gradient tillbaka till mitokondriell matris genom ATP-syntas för att producera ATP. OXPHOS är det mest effektiva sättet att producera ATP från energisubstrat och föredras i allmänhet i aeroba miljöer. Tidigare ansågs aerob glykolysproduktion av laktat från glukos medan syre är närvarande vara patofysiologisk, ofta ett kännetecken för cancerceller. Mer och mer upptäcks att vissa normala celltyper använder aerob glykolys av skäl som ännu inte har dechiffrerats helt.
Metabolisk flexibilitet är förmågan för celler eller organismer att anpassa sig till förändrade energibehov och tillgängliga bränslekällor. Till exempel tillgodoses den energiska efterfrågan på skelettmuskeln huvudsakligen av OXPHOS vid steady state men genom anaerob glykolys under högintensiv träning1. När träningstiden ökar bidrar glukos- och fettsyraoxidation mer till den totala energiproduktionen2. Användningen av substrat är emellertid inte enbart beroende av tillgänglighet, eftersom substrat antagonistiskt konkurrerar under oxidation. Framför allt har fettsyraoxidation visat sig hämma glukosutnyttjandet av skelettmuskeln i ett fenomen som kallas Randle-effekten3. En ömsesidig effekt visades genom efterföljande studier 4,5. Dessutom är många sjukdomar förknippade med en förändring i substratpreferens och utvecklingen av metabolisk inflexibilitet i celler. Till exempel reduceras fettsyraoxidationen i skelettmuskeln hos patienter med typ II-diabetes jämfört med normala kontrollpersoner6. De metaboliska förändringarna i sjukdomsinställningar är föremål för intensiv undersökning eftersom de kan bidra till patogenes.
Energimetabolismen i skelettcellstyper är relativt understuderad men har fått uppmärksamhet de senaste åren7. Tidigare arbete har visat att aerob glykolys är den dominerande energivägen i kalvariska osteoblaster, medan glukosoxidation genom TCA-cykeln spelar en roll vid osteoklastbildning 8,9. Andra har gett bevis för fettsyror som en energikälla för osteoblaster10. Glutaminkatabolism har också visat sig stödja osteoblastdifferentiering från förfäderna11,12. En övergripande förståelse för substratutnyttjande av olika skelettcelltyper saknas emellertid fortfarande. Dessutom förväntas förändringar i cellulär metabolism under celldifferentiering eller som svar på patologiska signaler förändra bränslesubstratutnyttjandet. Nedan beskrivs ett lättanvänt protokoll för analys av substratoxidation in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet ger en lättanvänd metod för att bestämma oxidationshastigheten för stora energisubstrat. Det är ett enklare alternativ till andra protokoll som använder kolvar som innehåller en central brunn och täckta med gummiproppar 14,15,16. Även om exempelstudien här utförs med cellodling kan metoden enkelt anpassas för vävnadsexplanter eller vävnadshomogenater som innehåller intakta mitokondrier, som tidigare b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes delvis av NIH-anslaget R01 AR060456 (FL). Vi tackar Dr. Michael Robinson och Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) för deras generösa hjälp med scintillationsdisken.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
