קליטת מינון של חשיפת תרכובות מבוססות פלטינה ורותניום בדגי זברה על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית עם יישומים רחבים יותר
Summary
הקצב המוגבר של ניתוחים פרמקו וטוקסיקוקינטיים של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת בדגי זברה יכול להוות יתרון למחקרי תרגום סביבתיים וקליניים. ההגבלה של ספיגת חשיפה לא ידועה הנישאת במים התגברה על ידי ביצוע ניתוח עקבות של מתכות על רקמת דגי זברה מעוכלים באמצעות ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.
Abstract
מתכות ותרכובות מבוססות מתכת מרכיבות קסנוביוטיקה פרמקו-אקטיבית וטוקסיקולוגית רב-תכליתית. מרעילות מתכות כבדות ועד כימותרפיה, לטוקסיקוקינטיקה של תרכובות אלה יש רלוונטיות היסטורית ומודרנית כאחד. דגי זברה הפכו לאורגניזם מודל אטרקטיבי בהבהרת פרמקו וטוקסיקוקינטיקה במחקרי חשיפה סביבתית ותרגום קליני. למרות שלמחקרים של דגי זברה יש יתרון בכך שהם בעלי תפוקה גבוהה יותר ממודלים של מכרסמים, ישנם מספר אילוצים משמעותיים למודל.
מגבלה אחת כזו טבועה במשטר המינון הנישא במים. לא ניתן לבצע אקסטרפולציה של ריכוזי מים ממחקרים אלה כדי לספק מינונים פנימיים אמינים. מדידות ישירות של התרכובות מבוססות המתכת מאפשרות מתאם טוב יותר עם תגובות מולקולריות וביולוגיות הקשורות לתרכובות. כדי להתגבר על מגבלה זו עבור מתכות ותרכובות מבוססות מתכת, פותחה טכניקה לעיכול רקמת זחל דגי זברה לאחר חשיפה ולכמת ריכוזי מתכות בתוך דגימות רקמה על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICPMS).
שיטות ICPMS שימשו לקביעת ריכוזי המתכת של פלטינה (Pt) מציספלטין ורותניום (Ru) ממספר כימותרפיות חדשניות המבוססות על Ru ברקמת דגי זברה. בנוסף, פרוטוקול זה הבחין בריכוזים של Pt שהיו מצומדים במקהלת הזחל בהשוואה לרקמת דגי הזברה. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן ליישם שיטה זו כדי לנפח את מינון המתכת הקיים ברקמות הזחל. יתר על כן, שיטה זו עשויה להיות מותאמת לזיהוי מתכות ספציפיות או תרכובות מבוססות מתכת במגוון רחב של מחקרי חשיפה ומינון.
Introduction
מתכות ותרכובות מבוססות מתכת ממשיכות להיות בעלות רלוונטיות פרמקולוגית וטוקסיקולוגית. השכיחות של חשיפה למתכות כבדות והשפעתה על הבריאות הגדילו באופן אקספוננציאלי את המחקר המדעי מאז שנות ה-60 והגיעו לשיא של כל הזמנים ב-2021. הריכוזים של מתכות כבדות במי שתייה, זיהום אוויר וחשיפה תעסוקתית חורגים מגבולות הרגולציה ברחבי העולם ונותרים בעיה עבור ארסן, קדמיום, כספית, כרום, עופרת ומתכות אחרות. שיטות חדשניות לכימות חשיפה סביבתית ולניתוח התפתחות פתולוגית ממשיכות להיות מבוקשות 1,2,3.
לעומת זאת, התחום הרפואי רתם את התכונות הפיזיוכימיות של מתכות שונות לטיפול קליני. לתרופות מבוססות מתכת או מטאלודרוגים יש היסטוריה עשירה של מטרות רפואיות והן הראו פעילות נגד מגוון מחלות, עם ההצלחה הגבוהה ביותר ככימותרפיה4. המפורסמת ביותר של metallodrugs, cisplatin, היא תרופה נגד סרטן מבוססת Pt הנחשבת על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כאחת התרופות החיוניות בעולם5. בשנת 2010, ציספלטין ונגזרותיו Pt היו בעלי שיעור הצלחה של עד 90% במספר סוגי סרטן והיו בשימוש בכ-50% ממשטרי הכימותרפיה 6,7,8. אף על פי שכימותרפיה מבוססת Pt זכתה להצלחה בלתי ניתנת לערעור, הרעילות המגבילה את המינון הניעה חקירות של תרופות חלופיות מבוססות מתכת עם אספקה ופעילות ביולוגית מזוקקת. מבין החלופות הללו, תרכובות מבוססות Ru הפכו ל-9,10,11,12 הפופולריות ביותר.
מודלים ומתודולוגיות חדשניים נדרשים כדי לעמוד בקצב הצורך במחקרים פרמקו-פרמקו-מתכתיים וטוקסיקוקינטיים. מודל דג הזברה נמצא בצומת של מורכבות ותפוקה, בהיותו בעל חוליות בעל נקבה גבוהה עם הומולוגיה גנטית שמורה של 70%13. מודל זה היה נכס בפרמקולוגיה ובטוקסיקולוגיה, עם בדיקות מקיפות לתרכובות שונות לגילוי עופרת, זיהוי מטרות ופעילות מכניסטית 14,15,16,17. עם זאת, סינון בתפוקה גבוהה של כימיקלים מסתמך בדרך כלל על חשיפות הנישאות במים. בהתחשב בכך שספיגה יכולה להיות משתנה בהתבסס על התכונות הפיזיקוכימיות של התרכובת בתמיסה (כלומר, פוטו-פירוק, מסיסות), זו יכולה להיות מגבלה עיקרית של קורלציה בין מתן מינון לתגובה.
כדי להתגבר על מגבלה זו לצורך השוואת המינון לבעלי חוליות גבוהים יותר, תוכננה מתודולוגיה לניתוח ריכוזי מתכות קורט ברקמת הזחל של דגי הזברה. כאן הוערכו עקומות מינון-תגובה של נקודות קצה קטלניות וסובלתליות עבור ציספלטין ותרכובות אנטי-סרטניות חדשניות המבוססות על Ru. קטלניות ועיכוב בבקיעה הוערכו בריכוזים נומינליים של 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ו-60 מ”ג/ל’ ציספלטין. הצטברות Pt ברקמת האורגניזם נקבעה על ידי ניתוח ICPMS, וספיגת אורגניזמים של מינונים בהתאמה הייתה 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ו-461.9 ננוגרם (Pt) לאורגניזם. בנוסף, זחלי דגי זברה נחשפו ל-0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 מ”ג/ל’ של PMC79. ריכוזים אלה נקבעו באופן אנליטי כמכילים 0, 0.17, 0.44, 0.66 ו-0.76 מ”ג/ל’ של Ru. פרוטוקול זה גם איפשר הבחנה בין ריכוזים של Pt sequestered בכוריון של הזחלים לעומת רקמת דגי הזברה. מתודולוגיה זו הצליחה לספק נתונים אמינים וחזקים להשוואות של פעילות פרמקו וטוקסיקוקינטית בין כימותרפיה מבוססת היטב לבין תרכובת חדשנית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן יושם כדי לקבוע את האספקה והקליטה של תרופות אנטי סרטניות מבוססות מתכת המכילות Pt או Ru. למרות ששיטות אלה כבר פורסמו, פרוטוקול זה דן בשיקולים ופרטים חשובים כדי להתאים מתודולוגיה זו למגוון תרכובות. פרוטוקול ה-OECD בשילוב עם עיכול רקמות וניתוח ICPMS אפשרו לנו לקבוע ש-PMC79 היה חזק ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון: NJAES-Rutgers NJ01201, מענק הכשרה של NIEHS T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. בנוסף, בריטני קאראס נתמכת על ידי מענק הכשרה T32NS115700 מ- NINDS, NIH. המחברים מכירים את אנדריאה ולנטה ואת הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) לאספקת PMC79.
Materials
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97 (2019).
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
- Lin, K., Zhao, Z. -. Z., Bo, H. -. B., Hao, X. -. J., Wang, J. -. Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , (2000).
- Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011)
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013)
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0 (2014)
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
