Absorción de dosis de exposición a compuestos a base de platino y rutenio en peces cebra mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente con aplicaciones más amplias
Summary
El aumento de la tasa de análisis farmacológicos y toxicocinéticos de metales y compuestos a base de metales en el pez cebra puede ser ventajoso para los estudios de traducción ambiental y clínica. La limitación de la absorción de exposición desconocida en el agua se superó mediante la realización de análisis de metales traza en tejido de pez cebra digerido mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente.
Abstract
Los metales y los compuestos a base de metales comprenden xenobióticos farmacoactivos y toxicológicos múltiples. Desde la toxicidad por metales pesados hasta la quimioterapéutica, la toxicocinética de estos compuestos tiene relevancia histórica y moderna. El pez cebra se ha convertido en un organismo modelo atractivo para dilucidar la farmacocinética y la toxicocinética en estudios de exposición ambiental y traducción clínica. Aunque los estudios de pez cebra tienen el beneficio de ser de mayor rendimiento que los modelos de roedores, hay varias restricciones significativas para el modelo.
Una de esas limitaciones es inherente al régimen de dosificación en el agua. Las concentraciones de agua de estos estudios no se pueden extrapolar para proporcionar dosis internas confiables. Las mediciones directas de los compuestos a base de metales permiten una mejor correlación con las respuestas moleculares y biológicas relacionadas con los compuestos. Para superar esta limitación para metales y compuestos a base de metales, se desarrolló una técnica para digerir el tejido larvario de pez cebra después de la exposición y cuantificar las concentraciones de metales dentro de las muestras de tejido mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICPMS).
Se utilizaron métodos ICPMS para determinar las concentraciones metálicas de platino (Pt) a partir de cisplatino y rutenio (Ru) de varios quimioterapéuticos novedosos basados en Ru en tejido de pez cebra. Además, este protocolo distinguió las concentraciones de Pt que fueron secuestradas en el corion de la larva en comparación con el tejido del pez cebra. Estos resultados indican que este método se puede aplicar para cuantificar la dosis de metal presente en los tejidos larvales. Además, este método puede ajustarse para identificar metales específicos o compuestos a base de metales en una amplia gama de estudios de exposición y dosificación.
Introduction
Los metales y los compuestos a base de metales siguen teniendo relevancia farmacológica y toxicológica. La prevalencia de la exposición a metales pesados y su impacto en la salud ha aumentado exponencialmente la investigación científica desde la década de 1960 y alcanzó un máximo histórico en 2021. Las concentraciones de metales pesados en el agua potable, la contaminación del aire y la exposición ocupacional exceden los límites regulatorios en todo el mundo y siguen siendo un problema para el arsénico, el cadmio, el mercurio, el cromo, el plomo y otros metales. Los métodos novedosos para cuantificar la exposición ambiental y analizar el desarrollo patológico siguenteniendo una gran demanda 1,2,3.
Por el contrario, el campo médico ha aprovechado las propiedades fisicoquímicas de varios metales para el tratamiento clínico. Los medicamentos a base de metales o metalodrugs tienen una rica historia de propósitos medicinales y han demostrado actividad contra una variedad de enfermedades, con el mayor éxito como la quimioterapéutica4. El más famoso de los metalofármacos, el cisplatino, es un medicamento contra el cáncer a base de Pt considerado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como uno de los medicamentos esenciales del mundo5. En 2010, el cisplatino y sus derivados Pt tuvieron una tasa de éxito de hasta el 90% en varios cánceres y se utilizaron en aproximadamente el 50% de los regímenes de quimioterapia 6,7,8. Aunque los quimioterapéuticos basados en Pt han tenido un éxito irrefutable, la toxicidad limitante de la dosis ha puesto en marcha investigaciones de fármacos alternativos a base de metales con administración y actividad biológica refinada. De estas alternativas, los compuestos a base de Ru se han convertido en losmás populares 9,10,11,12.
Se requieren nuevos modelos y metodología para mantener el ritmo de la tasa de necesidad de estudios farmacológicos y toxicocinéticos de metales. El modelo de pez cebra se encuentra en la intersección de complejidad y rendimiento, siendo un vertebrado de alta fecundidad con un 70% de homología génica conservada13. Este modelo ha sido un activo en farmacología y toxicología, con extensos exámenes de detección de diversos compuestos para el descubrimiento de plomo, la identificación de objetivos y la actividad mecanicista 14,15,16,17. Sin embargo, el cribado de alto rendimiento de productos químicos generalmente se basa en exposiciones transmitidas por el agua. Dado que la absorción puede ser variable en función de las propiedades fisicoquímicas del compuesto en solución (es decir, fotodegradación, solubilidad), esto puede ser una limitación importante para correlacionar la administración de dosis y la respuesta.
Para superar esta limitación para la comparación de la dosis con vertebrados superiores, se diseñó una metodología para analizar las concentraciones de metales traza en el tejido larvario del pez cebra. Aquí, se evaluaron las curvas dosis-respuesta de los criterios de valoración letales y subletales para el cisplatino y los nuevos compuestos anticancerígenos a base de Ru. La letalidad y el retraso en la eclosión se evaluaron para concentraciones nominales de 0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 mg/L de cisplatino. La acumulación de Pt en el tejido del organismo se determinó mediante el análisis de ICPMS, y la absorción del organismo de las dosis respectivas fue de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 y 461,9 ng (Pt) por organismo. Además, las larvas de pez cebra fueron expuestas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L de PMC79. Estas concentraciones se determinaron analíticamente para contener 0, 0,17, 0,44, 0,66 y 0,76 mg/L de Ru. Este protocolo también permitió distinguir las concentraciones de Pt secuestrado en el corion de las larvas en comparación con el tejido del pez cebra. Esta metodología fue capaz de proporcionar datos fiables y sólidos para las comparaciones de la actividad farmacocinética y toxicocinética entre un quimioterapéutico bien establecido y un compuesto nuevo. Este método se puede aplicar a una amplia gama de metales y compuestos a base de metales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí se ha implementado para determinar la administración y la absorción de medicamentos contra el cáncer a base de metal que contienen Pt o Ru. Aunque estos métodos ya han sido publicados, este protocolo discute consideraciones y detalles importantes para adaptar esta metodología para una variedad de compuestos. El protocolo de la OCDE junto con la digestión tisular y el análisis ICPMS nos permitió determinar que PMC79 era más potente que el cisplatino y dio lugar a una acumulación de te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiación: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Además, Brittany Karas cuenta con el apoyo de la subvención de capacitación T32NS115700 de NINDS, NIH. Los autores reconocen a Andreia Valente y a la Fundación Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología (FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) para el suministro de PMC79.
Materials
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
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