Summary
Proteomische ontregeling speelt een belangrijke rol bij de verspreiding van diffuus infiltrerende gliomen, maar verschillende relevante eiwitten blijven ongeïdentificeerd. Digitale ruimtelijke verwerking (DSP) biedt een efficiënte, high-throughput benadering voor het karakteriseren van de differentiële expressie van kandidaat-eiwitten die kunnen bijdragen aan de invasie en migratie van infiltratieve gliomen.
Abstract
Diffuus infiltrerende gliomen zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit als gevolg van de infiltratieve aard van tumorverspreiding. Het zijn morfologisch complexe tumoren, met een hoge mate van proteomische variabiliteit over zowel de tumor zelf als zijn heterogene micro-omgeving. Het kwaadaardige potentieel van deze tumoren wordt versterkt door de ontregeling van eiwitten die betrokken zijn bij verschillende belangrijke routes, waaronder processen die de cellulaire stabiliteit handhaven en de structurele integriteit van de micro-omgeving behouden. Hoewel er talloze bulk- en eencellige glioomanalyses zijn geweest, is er een relatief gebrek aan ruimtelijke stratificatie van deze proteomische gegevens. Het begrijpen van verschillen in ruimtelijke verdeling van tumorigene factoren en immuuncelpopulaties tussen de intrinsieke tumor, invasieve rand en micro-omgeving biedt waardevol inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan tumorproliferatie en -verspreiding. Digitale ruimtelijke profilering (DSP) vertegenwoordigt een krachtige technologie die de basis kan vormen voor deze belangrijke meerlagige analyses.
DSP is een methode die efficiënt eiwitexpressie kwantificeert binnen door de gebruiker gespecificeerde ruimtelijke gebieden in een weefselmonster. DSP is ideaal voor het bestuderen van de differentiële expressie van meerdere eiwitten binnen en tussen onderscheidregio's, waardoor meerdere niveaus van kwantitatieve en kwalitatieve analyse mogelijk zijn. Het DSP-protocol is systematisch en gebruiksvriendelijk, waardoor ruimtelijke analyse van proteomische gegevens op maat mogelijk is. In dit experiment worden weefselmicroarrays opgebouwd uit gearchiveerde glioblastoomkernbiopten. Vervolgens wordt een panel van antilichamen geselecteerd, gericht op eiwitten van belang in het monster. De antilichamen, die worden voorgeconjugeerd tot UV-fotocleavable DNA-oligonucleotiden, worden vervolgens 's nachts geïncubeerd met het weefselmonster. Onder fluorescentiemicroscopievisualisatie van de antilichamen worden regio's van belang (ROI's) gedefinieerd waarbinnen eiwitexpressie kan worden gekwantificeerd met de monsters. UV-licht wordt vervolgens gericht op elke ROI, waarbij de DNA-oligonucleotiden worden gesplitst. De oligonucleotiden worden gemicroaspirateerd en geteld binnen elke ROI, waarbij het overeenkomstige eiwit op ruimtelijke basis wordt gekwantificeerd.
Introduction
Diffuus infiltrerende gliomen zijn het meest voorkomende type kwaadaardige hersentumor bij volwassenen en zijn steevast dodelijk. De neiging voor glioomcellen om uitgebreid in de hersenen te migreren is een grote therapeutische uitdaging. Het mechanisme waarmee ze zich verspreiden, omvat gerichte migratie en ongecontroleerde invasie. Van invasieve glioomcellen is aangetoond dat ze tropisme en migratie vertonen langs witte stofkanalen1, waarbij recent onderzoek demyelinisatie van deze kanalen impliceert als een actief, protumorigene eigenschap2. Invasie wordt gemedieerd door een epitheliale naar mesenchymale overgang, waarbij glioomcellen mesenchymale eigenschappen verwerven door de expressie van genen die coderen voor extracellulaire matrixeiwitten en celadhesiemoleculen te verminderen, migratie te versterken en de voortplanting door de tumormicro-omgeving te vergemakkelijken 3,4,5.
Op moleculair niveau is verstoring van verschillende eiwitten aangetoond die cellulaire stabiliteit en interface met immunogene componenten verlenen6. Van infiltratieve gliomen is bekend dat ze onderdrukking ondergaan van eiwitten met anti-apoptotische (bijv. PTEN) eigenschappen7. Ze overexpressie ook eiwitten die het ontwijken van de immuunrespons van de gastheer bevorderen (bijv. PD1 / PDL1)8. De ontregeling van deze complexe paden verbetert de tumorigeniciteit en verhoogt het kwaadaardige potentieel.
Binnen monsters van invasief glioom was het doel om de differentiële expressie van eiwitten te evalueren die essentieel zijn voor celgroei, overleving en proliferatie, en voor de structurele integriteit van micro-omgeving tussen invasieve en niet-invasieve componenten. Daarnaast probeerden we de differentiële regulatie van eiwitten met een actieve immunogene rol te bestuderen, waardoor we inzicht kregen in het mechanisme waarmee gecompromitteerde immuunafweer van de gastheer het proliferatieve en invasieve potentieel van gliomen kan verbeteren. Dit is vooral relevant gezien de recente breedte van onderzoek dat aantoont hoe immuunmarkers en drivers van ontregeling bij maligniteit kunnen dienen als doelwitten van immunotherapie. Het identificeren van levensvatbare therapeutische doelen onder de vele eiwitten die betrokken zijn bij immunosurveillance en reactiviteit vereist een zeer gevoelige en alomvattende aanpak.
Gezien het brede scala aan kandidaat-eiwitten dat kan worden bestudeerd, zochten we naar een methode die lijkt op immunohistochemie, maar met verbeterde efficiëntie van gegevensverwerking. Op het gebied van kankerbiologie is DSP naar voren gekomen als een krachtige technologie met belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve hulpmiddelen voor proteomische analyse en kwantificering. Het kenmerk van DSP is de multiplexing-capaciteit met hoge doorvoer, waardoor gelijktijdige studie van verschillende eiwitten in een monster mogelijk is, wat een belangrijk onderscheid markeert met standaard maar lagere plextechnologieën zoals immunohistochemie (IHC)9,10. De multiplexfunctie van DSP doet geen afbreuk aan de betrouwbaarheid ervan als een kwantitatief en analytisch hulpmiddel, zoals aangetoond door studies die DSP vergelijken met IHC. Bij gebruik voor proteomische kwantificering van niet-kleincellige longkankermonsters, bijvoorbeeld, is aangetoond dat DSP vergelijkbare resultaten heeft als IHC11. Bovendien biedt DSP aanpasbare regionale specificatie, waarin gebruikers handmatig regio's kunnen definiëren waarbinnen proteomische analyse kan worden uitgevoerd. Dit biedt een voordeel ten opzichte van multiplexmethoden met een hele sectie10,12. In een enkele verwerkingsronde biedt DSP dus meerdere analyselagen door verschillende eiwitdoelen in meerdere interessegebieden te onderzoeken.
DSP heeft toepassingen in verschillende pathologische omgevingen. DSP is vooral voordelig in oncologische analyse, omdat ruimtelijke variatie kan correleren met cellulaire transformatie en differentiële eiwitexpressie. DSP is bijvoorbeeld gebruikt om het proteomische profiel van borstkanker te vergelijken met de aangrenzende tumormicro-omgeving. Dit heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van de natuurlijke geschiedenis van deze tumor en de progressie ervan, evenals de mogelijke respons op behandeling13. Aanvullende contexten die de veelzijdigheid van DSP illustreren, zijn onder meer ruimtelijke kwantificering van eiwitdiversiteit bij prostaatkanker14, associatie van immuuncelmarkerexpressie met ziekteprogressie in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom15, en demonstratie van een epitheliaal-mesenchymale gradiënt van eiwitexpressie die gemetastaseerde van primaire heldercellige eierstokkanker onderscheidt16 . Door DSP te implementeren, karakteriseren we de ruimtelijke topografie van eiwitten die tumorigenese en invasie van gliomen kunnen beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderstaande protocol volgt de richtlijnen van de Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten van wie weefselmonsters in dit onderzoek waren opgenomen. Zie de sectie Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Dia voorbereiding17
- Ophalen of bereiden formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed weefsel van menselijke volwassen type diffuus infiltrerende gliomen.
OPMERKING: In dit experiment werden in paraffine ingebedde blokken biopsieën van drie patiënten met glioblastoom gebruikt. - Maak een weefsel microarray (TMA) blok. Neem verschillende kernen van 2 mm uit elke biopsie en plaats ze in een enkel TMA-blok (figuur 1, boven). Snijd secties uit het TMA-blok op 4 μm en monteer op glazen dia's. Plaats elke glijbaan in de pakking van de schuifhouder. Incubeer de glijbaan bij 60 °C gedurende 30 min.
2. Semi-geautomatiseerde IHC-systeemvoorbereiding en softwareconfiguratie (voor het laden en uitvoeren van dia's)17
- Stel de reagentia in. Klik op de knop Reagens instellen . Klik op Toevoegen op het tabblad Instellingen .
- Registreer een wasbuffer door er een naam voor te typen in het veld Naam . Selecteer Ancillary in het veld Type . Klik op Opslaan.
- Registreer een blokkeringsoplossing door dezelfde stappen te herhalen als hierboven (indien van toepassing gewijzigd, bijvoorbeeld in het veld Naam ), maar door Primair antilichaam te selecteren in het veld Type . Selecteer de gewenste protocollen in de vervolgkeuzelijsten voor Standaardkleuringsprotocol en Standaard HIER-protocol. Selecteer desgewenst een optie Standaard enzymprotocol (dit vak is leeg gelaten in het huidige protocol). Klik op Opslaan.
- Registreer het detectiesysteem, bestaande uit een reagenscontainercontainer met streepjescode. Scan de streepjescode.
- Begin met het invoeren van de gegevens van het reagenssysteem in het venster Reagenssysteem toevoegen . Typ een naam voor het detectiesysteem.
- Typ een vervaldatum. Markeer de eerste rij van de reagentiagrafiek en scan de streepjescode van een nieuwe reagenscontainer van 30 ml, waarna de streepjescode rij 1 vult.
- Plaats de container op plaats 1 van het detectiesysteem. Selecteer de naam van de wasbuffer in de vervolgkeuzelijst van de kolom Reagens en klik op Toevoegen. Herhaal deze stappen om eventuele extra reagentia toe te voegen aan volgende rijen, inclusief de blokkeringsoplossing.
- Stel het Protein Protocol voor IHC in. Klik op Protocol Setup ( Protocol Setup ). Markeer de rij die overeenkomt met het gewenste protocol en klik op Kopiëren. Voer de naam in en vul eventuele andere relevante velden in het venster Protocoleigenschappen bewerken in.
- Schakel het vakje in voor Wash Steps weergeven. Controleer of de velden Inc (min) en DispenseType correct zijn voor elk reagens (10 min voor de blokkeringsoplossing, 0 min voor de wasbuffer en 150 μl voor elk dispensetype). Klik op Opslaan.
- Bereid het onderzoek voor. Vul de container op positie 1 met een washbuffer. Vul 150 μL per dia en 5 ml dood volume; laat het deksel open. Herhaal deze stappen voor de container op positie 2, die moet worden gevuld met een blokkeringsoplossing. Deze container moet 150 μL per dia en 350 μL dood volume hebben.
- Plaats de reagenscontainerlade op de machine. Laat het systeem containerherkennings- en volumebevestigingsmaatregelen uitvoeren. Klik op Slide Setup | Studie toevoegen. Voer de studie-ID en studienaam in en selecteer 150 μL onder Dispense Volume | het gewenste protocol in de vervolgkeuzelijst Voorbereidingsprotocol (Bakken en was wordt voorgesteld). Markeer de studie en klik op Dia toevoegen.
- Selecteer Test Tissue onder Tissue Type | 150 μL onder Dispense Volume | Single en Routine uit de vervolgkeuzelijsten Kleuringmodus. Selecteer een proces (IHC voor het huidige onderzoek) | de naam van de blokkeringsoplossing in de vervolgkeuzelijst van het veld Markering | IHC DSP Protocol in het kleuringsveld van het tabblad Protocollen | *Bak en was voor bereiding | *HIER 20 min met ER1 voor HIER. Laat het veld Enzyme leeg.
- Herhaal dit proces voor elke dia. Klik op Sluiten als u klaar bent en klik vervolgens op Etiketten afdrukken. Controleer alle dialabels die nog niet zijn afgedrukt voor het huidige onderzoek en klik op Afdrukken. Plak labels op de bovenkanten van de dia's.
- Laad en voer dia's uit. Plaats de dia's op de schuiflade en zorg ervoor dat het monster en het label naar boven gericht zijn. Plaats de afdektegels over de dia's en zorg ervoor dat de dia's zijn georiënteerd met tabbladen aan de onderkant. Plaats de schuiflades op het instrument.
- Druk op de LED-knop om de lade te laten zakken en het instrument te laten beginnen met het scannen en herkennen van dia's. Klik op de knop Start om het experiment te starten.
- Voltooi het experiment. Druk op de LED-knop wanneer deze groen knippert, wat aangeeft dat de uitvoering is voltooid. Verwijder de lade van het instrument en til de afdektegels voorzichtig van elke dia op. Plaats de dia's in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), verwijder overtollige buffer en schets elke weefselsectie met een hydrofobe pen om een hydrofobe barrière te creëren.
3. Antilichaam incubatie en kernkleuring17
- Selecteer een panel van antilichamen om de antigenen van belang te lokaliseren (zie tabel 1 voor antilichamen die in dit experiment worden gebruikt).
OPMERKING: Elk antilichaam is al geconjugeerd aan een DNA-oligonucleotide met een UV-fotocleavable segment (PC-oligo) dat het uniek identificeert (indexerende oligo's, figuur 2). - Maak een werkende antilichaam-PC-oligo-oplossing door voor elke dia 8 μL van elk antilichaam (verdund 1:40) in het paneel toe te voegen. Gebruik het blokkerende reagens als verdunningsmiddel om het uiteindelijke volume van 200 μL voor elke dia te bereiken. Incubeer een nacht bij 4 °C (figuur 3, stap 1).
OPMERKING: Morfologiemarkers, biologische kleurstoffen of fluorescerend gelabelde antilichamen kunnen in deze stap ook aan de oplossing worden toegevoegd. - Plaats de volgende dag de glijbaan in een Coplin pot en was 3 x 10 min in 1x TBS-T. Postfix in 4% paraformaldehyde gedurende 30 min bij kamertemperatuur, gevolgd door 2 x 5 min in 1x TBS-T.
- Voeg SYTO13 kernvlek (verdund 1:10 in 1x TBS) toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was 2x met 1x TBS-T, en bewaar de dia dan in 1x TBS-T.
4. Fluorescentievisualisatie, ROI-identificatie en UV-fotosessie op het DSP-instrument17
- Nadat u de muisaanwijzer op Gegevensverzameling in het bedieningspaneel hebt geplaatst, selecteert u Nieuw/Doorgaan met uitvoeren.
- Plaats de dia in de diahouder, met het label naar de gebruiker toe. Laat de schuifladeklem zakken en zorg ervoor dat het weefsel zichtbaar is in het langwerpige venster. Voeg 6 ml buffer S toe.
- Volg de aanwijzingen in het Control Center. Zoom tussen verschillende assen met de X- en Y-schuifregelaars om een gebied af te bakenen dat moet worden gescand. Selecteer Scannen. Laat de scan doorgaan totdat het volledige gedefinieerde doelgebied is afgebeeld.
- Genereer een afbeelding van 20x. Definieer de ROI's automatisch of handmatig (figuur 3, stap 2). Om dit protocol te volgen, selecteert u drie even grote, cirkelvormige URI's (diameter van 250 μm) voor elke weefselkern (figuur 4, onderaan).
OPMERKING: ROI's zijn aanpasbaar in grootte en vorm. Binnen elke sectie kunnen verschillende ROI's worden geselecteerd. In dit experiment worden circulaire ROI's handmatig gedefinieerd. - Keur de ROI's goed door op de knop Scanwerkruimte afsluiten te klikken. Wacht tot UV-licht de oligo's van de antilichamen splijt.
- Wanneer het reinigingsinstrumentproces is voltooid, selecteert u Nieuwe gegevensverzameling om door te gaan met de huidige dia's of plaat. Anders selecteert u Dia's en Microplaat verwijderen.
- Open het venster Plaat voltooien door te dubbelklikken op het plaatpictogramgebied rechtsonder in het bedieningspaneel. Als het lotnummer van het Hybridization (Hyb) Code Pack (#) bekend is, voert u het nummer in en klikt u op Bijwerken (optioneel tijdens deze stap). Klik op Afronden.
- Koppel de schuifhouder en de opvangplaat los door de aanwijzingen te volgen. Bewaar de dia's in TBS-T. Als de dia's lange tijd niet worden gebruikt, bedek ze dan met een waterig medium en coverslip.
5. Eiwituitlezing17
- Gebruik een doorlatende afdichting en droog de aspiraten bij 65 °C in een thermische cycler met de bovenkant open. Voeg 7 μL diethyl pyrocarbonaat behandeld water toe en meng. Incubeer op RT gedurende 10 minuten en draai dan snel naar beneden.
- Kies de juiste Probe R- en Probe U-vergelijkingen uit tabel 2 om de creatie van de probe/buffermix te begeleiden. Op basis van het aantal Hyb-codes dat nodig is voor hybridisatie in het huidige experiment, past u vergelijking (1) toe zoals hieronder. Meng en draai snel naar beneden.
# Hyb Codes Probe R Working Pool Probe U Working Pool Hybridization Buffer n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - Voeg 84 μL probe/buffermix toe aan elk te gebruiken Hyb-codepakket. Veeg om te mixen en draai naar beneden. Voeg in een verse 96-well Hybridisatieplaat 8 μL van elke Hyb Code Master Mix toe aan alle 12 putten van de aangegeven rij.
- Breng 7 μL over van de DSP-opvangplaat naar de overeenkomstige put in de hybridisatieplaat. Meng voorzichtig. Heat-seal en voer een snelle spin uit. Incubeer vervolgens een nacht bij 67 °C. Koel de plaat af op ijs en maak een snelle draai.
- Pool de hyb-producten van elke put in een stripbuis en pipeer elke put voorzichtig 5x om te mengen. Sluit de stripbuis af en draai naar beneden. Vries alle resterende ongepoolde hybproducten in bij -80 °C. Laad de stripbuizen in het analysesysteem.
- Sla het CDF-bestand op een USB-station op en breng de gegevens vervolgens over van het DSP-instrument naar de Digital Analyzer. Voltooi de installatie door de volgende stappen uit te voeren.
- Laad verbruiksartikelen en samengevoegde monsters op het voorbereidingsstation. Druk op het scherm op Verwerking starten. Selecteer Hoge gevoeligheid, gevolgd door Volgende. Druk op Alles selecteren voor het aantal putten met monsters | | afwerken Volgende op e-mail notificatie | Begin.
- Zodra het voorbereidingsstation is voltooid, verzegelt u de cartridge en brengt u deze over naar de digitale analyzer. Druk op Tellen starten, selecteer Stage Position, druk op Bestaand CDF-bestand laden en selecteer eerder geüpload bestand. Druk op Gereed, selecteer de fasepositie nogmaals, druk op Gereed | Begin met het uitvoeren van het programma.
- Sla het gezipte bestand van de conversiebestanden van het aantal reporters van het analysesysteem op een USB-station op en plaats het station vervolgens in de DSP-machine. Plaats in het DSP Control Center de muisaanwijzer op Gegevensverzameling en klik vervolgens op Upload Counts. Selecteer het relevante gezipte bestand.
6. Gegevensanalyse17
- Klik op Records in het DSP Control Center. Als u scans in de wachtrij wilt weergeven, selecteert u Geselecteerde scans toevoegen aan wachtrij | Mijn analysewachtrij. Selecteer Nieuw onderzoek in wachtrij nadat u de muisaanwijzer op de optie Gegevensanalyse in het bedieningspaneel hebt geplaatst.
- Kies QC in de opties op de taakbalk. Ga verder met de standaardwaarden of pas indien gewenst aan. Selecteer QC uitvoeren en bekijk het resultatenraster. Klik op QC uitvoeren om door te gaan en een nieuwe dataset te maken, waarbij de waarden worden genormaliseerd naar de positieve hybridisatiebesturingselementen.
- Importeer de nieuwe tags in een XLSX-bestand. Selecteer Annotaties beheren in het deelvenster Scans en download vervolgens een sjabloon, voeg de tags in en importeer het bestand.
- OPTIONEEL: Nadat u QC hebt uitgevoerd, past u de gegevens verder aan met andere werkbalkopties. Gebruik gereedschappen in het deelvenster Visualisaties om de getransformeerde gegevens te plotten.
- Navigeer door de grijze vervolgkeuzelijst met parameters om elke plot in het deelvenster Visualisaties samen te stellen. Selecteer een bepaald gebied binnen een plot om de bijbehorende gemarkeerde segmenten in het deelvenster Scans te visualiseren en klik met de rechtermuisknop om tags of groepen te genereren. Bekijk in datasetoverzicht plots van Normalisatie, Schalen en andere opties voor analyse en weergave.
- Sla een visualisatie op door het pictogram opslaan te selecteren; bekijk visualisaties die al zijn opgeslagen onder Samenvatting. Selecteer de knop Exporteren (.svg) om een visualisatie in .svg-indeling te exporteren. Exporteer gegevens waarop een visualisatie is gebaseerd door op de knop Exporteren (.xlsx) te klikken. Exporteer alle gegevens in een specifieke gegevensset door de cursor over de naam van de gegevensset in het tweede deelvenster te bewegen en op het exportpictogram te klikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 toont de representatieve resultaten van een DSP-experiment uitgevoerd op monsters van glioblastoom. Er wordt een heatmap gepresenteerd, die een van de methoden illustreert waarmee gegevens visueel kunnen worden vastgelegd met behulp van de DSP-software. Rijen vertegenwoordigen eiwitdoelen en elke kolom komt overeen met een interessegebied. Een kleurbereik van blauw tot rood duidt respectievelijk op een lage tot hoge expressie. Variabiliteit van kleur binnen een rij weerspiegelt regionale eiwitheterogeniteit en suggereert een mogelijke ruimtelijke associatie met differentiële eiwitexpressie. In het huidige experiment zijn S100 en CD56 bijvoorbeeld universeel hoog omdat ze neurale markers zijn.
Markers met de meeste variabiliteit waren B7-H3, Ki-67, CD44 en fibronectine. Deze markers hebben belangrijke associaties met respectievelijk tumorproliferatie, migratie en metastase. Het is dus redelijk dat ze regionale variabiliteit vertonen tussen monsters van kwaadaardige kern, kwaadaardige invasie en niet-kwaadaardig weefsel. Numerieke gegevensrepresentatie is ook mogelijk; een bestand met de expressiewaarde van elke eiwitmarker binnen een ROI in tabelvorm kan worden geëxporteerd voor wiskundige en statistische analyse. Deze expressiewaarde wordt geproduceerd door de digitale telfunctie die beschikbaar is via DSP, die de microaspirated PC-oligos binnen elke ROI kwantificeert (figuur 1 en figuur 2).
Figuur 1: Het definiëren van gebieden die van belang zijn voor weefselmicroarray van glioblastoombiopten. Top, Hematoxyline en eosine-gekleurd gedeelte van weefselmicroarray met verschillende kernbiopten met een diameter van 2 mm van in totaal drie glioblastoompatiënten. Onderaan, interessante gebieden gedefinieerd op fluorescentiebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fotocleavable oligonucleotiden. Antilichaam- of antisense oligonucleotide-probes voor respectievelijk eiwit- of RNA-doelwitten zijn covalent gekoppeld aan oligonucleotiden met fotocleavable linkers. Weefselsecties worden gekleurd met de sondes. UV-licht wordt vervolgens gericht op ROIs om de PC-oligos vrij te maken, die digitaal worden geteld. Dit cijfer is aangepast van9, met toestemming van Springer Nature (copyright 2020). Afkortingen: PC-oligos = fotocleavable oligonucleotiden; ROI's = interessante regio's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: DSP-procedure. 1) Weefselverwerking: Een weefselglaasje wordt gekleurd met oligo-geconjugeerde antilichaam- of RNA-sondes. 2) ROI-selectie: De weefseldia wordt in beeld gebracht en ROI's worden handmatig of automatisch afgebakend op basis van bepaalde fluorescentiepatronen. 3) Splitsing van geconjugeerde oligonucleotiden: UV-licht wordt gericht op de ROIs, wat resulteert in splitsing van de fotocleavable oligonucleotiden. 4) PC-oligo collectie: De PC-oligo's worden aangezogen in een microcapillaire buis. 5) Plating: Geaspireerde PC-oligo's worden afgezet in een microtiterplaat. 6) Herhaal: Stappen 3-5 worden herhaald voor elke ROI; tussen elke cyclus wordt zorgvuldig wassen uitgevoerd. 7) Kwantificering: Ruimtelijk opgeloste pools van PC-oligo's kunnen worden gehybridiseerd tot fluorescerende barcodes; dit maakt het mogelijk om tot ongeveer 1 miljoen bindingsgebeurtenissen per ROI digitaal te tellen. Als alternatief kunnen PC-oligo's worden gekwantificeerd via NGS, waarbij de volledige microtiterplaat in één buis wordt samengevoegd en gesequenced. De reads worden vervolgens vertaald in digitale tellingen en teruggekoppeld naar hun oorspronkelijke ROI, waardoor een visuele kaart van eiwit- of RNA-expressie binnen elke weefselsectie ontstaat. Dit cijfer is aangepast van9, met toestemming van Springer Nature (copyright 2020). Afkortingen: DSP = digitale ruimtelijke verwerking; PC-oligos = fotocleavable oligonucleotiden; URI's = interessante regio's; NGS = next-generation sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve heatmap van een DSP-experiment. Kolommen vertegenwoordigen afzonderlijke regio's van belang. Rijen vertegenwoordigen een eiwitdoel. Lage expressie wordt weergegeven in blauw en hoge expressie wordt weergegeven in rood. Afkorting: DSP = digitale ruimtelijke verwerking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| GeoMx Immune Cell Profiling - menselijk | Pan-Tumor Module |
| PD-1 | Mart1 |
| cd68 | Ny-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 | Bcl-2 |
| Bèta-2 microglobuline | EpCAM |
| CD11C | Her2 |
| cd20 | Pten |
| Cd3 | ER-alfa |
| Cd4 | PR |
| cd45 | |
| cd56 | |
| cd8 | |
| Ctla4 | |
| GZMB | |
| PD-L1 | |
| Panck | |
| SMA | |
| Fibronectine | |
| Rb IgG | |
| mevrouw IgG1 | |
| mevrouw IgG2a | |
| Histon H3 | |
| S6 | |
| Gapdh |
Tabel 1: Een representatief monster van eiwitten dat kan worden beoordeeld met behulp van vooraf ontworpen antilichaampanelen.
| Probe U Werkpool | ||||||
| Module 2 Sonde R | Andere modules | DEPC-behandeld water (microliter) | totaal volume (microliter) | Sonde U Master Stock (microliter) | DEPC-behandeld water (microliter) | totaal volume |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
Tabel 2: Hybridisatiecodes en probe R- en probe U-werkpools. Afkorting: hyb = hybridisatie; DEPC = diethylpyrocarbonaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien de diversiteit aan eiwitten die mogelijk de agressiviteit van gliomen kunnen beïnvloeden en het idee dat verschillende van deze eiwitten onontdekt blijven, is een high-throughput eiwitkwantificeringsmethode een ideale technologische benadering. Aangezien ruimtelijke gegevens in oncologische monsters vaak correleren met differentiële expressie18, maakt het opnemen van ruimtelijke profilering in de eiwitkwantificeringsbenadering bovendien een effectievere analyse mogelijk.
De high-throughput benadering van DSP maakt het ook mogelijk om het te gebruiken in een shotgun-achtige benadering, die ideaal is voor het ontdekken van potentiële nieuwe biomarkers van ziekte en respons op therapie. In twee studies met melanoom werd DSP gebruikt om de responsen op combinatietherapie met ipilimumab en nivolumab versus nivolumab monotherapie19 en op neoadjuvante combinatietherapie met ipilimumab en nivolumab versus standaard adjuvante behandeling20 te evalueren. In beide studies toonde DSP-profilering van een verscheidenheid aan eiwitdoelen na de behandeling differentiële relatieve expressie van belangrijke immunologische markers, wat een rol suggereert voor potentiële biomarkers van therapeutische respons.
DSP vergemakkelijkt ook de bepaling van de uiteindelijke pathologische betekenis van complexe processen op moleculair niveau. Een onderscheidend kenmerk van invasieve gliomen is bijvoorbeeld hun neiging om rechtstreeks door de extracellulaire matrix (ECM) te migreren, en hun migratiepad wordt vaak geleid door vasculaire en witte stofkanalen 1,2. Variabiliteit in eiwitexpressie van de weefselmicro-omgeving is een kenmerk van de epitheliale naar mesenchymale overgang die invasie aandrijft. Verschillende studies hebben onderzocht hoe gliomen matrix metalloproteinases (MMP's) kunnen upreguleren, wat resulteert in de afbraak van de omliggende ECM en toenemende invasiviteit 21,22,23. Door het cumulatieve, downstream-effect van deze differentiële regulatie te visualiseren en te kwantificeren, biedt DSP een grootschalige, holistische analyse.
Een belangrijke determinant van het kwaadaardige potentieel van gliomen is hun vermogen om te interageren met en te manipuleren immuunafweer van de gastheer. Net als andere solide tumoren gebruiken gliomen verschillende mechanismen om de immunosurveillance van de gastheer te ontwijken en de activering van eiwitten te verstoren die cruciaal zijn voor het opbouwen van een immuunrespons. Recente ontwikkelingen in immuno-oncologie hebben zich gericht op het identificeren van immunogene eiwitten die tot expressie worden gebracht of geëxploiteerd door tumoren. In de voorhoede van deze ontwikkelingen staan het gebruik van T-cellen om immunologisch actieve tumorantigenen te detecteren waartegen oncolytische virussen kunnen worden gericht24,25, en de ontwikkeling van checkpointremmers tegen T-cel remmende eiwitten (bijv. PD1 / PDL1 en CTLA4) om de immuniteit van de gastheer tegen tumoren te versterken26,27 . Andere stromale populaties die prominent in de glioommicro-omgeving voorkomen, zijn macrofagen, microvasculaire endotheelcellen, immuuncellen en een recent geïdentificeerde subpopulatie die 'glioom-geassocieerde stromale cellen' (GASC's) wordt genoemd28. De interacties van deze cellen met chemokines, cytokines en componenten van de ECM hebben belangrijke implicaties voor tumorproliferatie, invasie en respons op behandeling, en dienen dus als belangrijke doelen voor regionale kwantificering en vergelijking door middel van technologieën zoals DSP.
Het DSP-protocol is gebruiksvriendelijk en maakt meerdere aanpassingslagen mogelijk. Omdat een groot deel van het kwantificeringsproces geautomatiseerd is, zijn de belangrijkste gebruikersafhankelijke stappen gericht op het bereiken van de hoogst mogelijke gevoeligheid en specificiteit van doeldetectie. Belangrijke stappen binnen het protocol omvatten dus het bepalen van een vlek voor de eerste fluorescerende visualisatie van het monster, afbakening van ROI's en selectie van de antilichaampanelen.
Bij het ontwerpen van een kleuringsprotocol is het belangrijk om eerst een doelwit te identificeren dat waarschijnlijk kwantificeerbare verschillen tussen verschillende regio's van het monster zal aantonen, overeenkomend met een kritisch kenmerk of gedrag van het weefsel van herkomst. Vervolgens moet een agent worden geselecteerd die het doel effectief zal binden. Als men bijvoorbeeld hoopt gebieden van hyperplasie of nucleaire atypie te visualiseren, kan H &E of een nucleaire vlek worden gekozen; als alternatief, als het doel is om veranderingen in de expressie van een gen waarvan bekend is dat het geassocieerd is met kwaadaardige of premaligne weefsels te visualiseren, kan een fluorofoor-geconjugeerd antilichaam worden gekozen. De tumorcellen zelf kunnen specifiek worden gelabeld in het geval van IDH1-R132H mutante tumoren. Het huidige protocol kan worden gewijzigd door de toevoeging van fluorescerend gelabeld IDH1-R132H als morfologische marker (protocol stap 3.2). Er mogen maximaal vier vlekken per monster worden gebruikt. Zodra visualisatie van het gekleurde weefsel heeft plaatsgevonden, worden ROI's aangewezen. De selectie van ROIs moet rekening houden met de vraag waar significante verschillen in eiwitdoelexpressie naar verwachting zullen optreden. Belangrijke overwegingen bij het selecteren van ROI's zijn grootte (diameter 10-600 μm), vorm (cirkel, rechthoek of door de gebruiker getekend) en segmentatie (verdere afbakening van subregio's binnen één ROI, met een extra potentiële analyselaag). Deze variabelen moeten worden geoptimaliseerd om de ruimtelijke variatie in doelexpressie die wordt verwacht op basis van het geselecteerde antilichaampaneel zo effectief mogelijk vast te leggen.
Selectie van het antilichaampanel is van cruciaal belang, omdat differentiële antilichaamexpressie uiteindelijk dient als eindpunt van de studie. Bij het uitvoeren van deze stap is het belangrijk om te overwegen welke markers expressie kunnen vertonen die positief of negatief correleert met stadia langs het spectrum van tumorontwikkeling, van goedaardig, tot pre-invasief, tot invasief of kwaadaardig. Het is ook belangrijk om de eigenschappen van zowel het weefsel van oorsprong als het tumortype zorgvuldig te overwegen, omdat beide kenmerken de expressie van bepaalde markers kunnen beïnvloeden.
Omdat een groot deel van het proces geautomatiseerd is, zijn eventuele fouten in de procedure over het algemeen te wijten aan hardware- of softwarestoringen, waardoor de gebruiker beperkte mogelijkheden biedt om problemen op te lossen. Problemen die zich kunnen voordoen, zijn onder meer verstoring van de ingebouwde kwaliteitscontrole (QC) -maatregel (ontworpen om gegevens te markeren en mogelijk weg te laten die wijzen op een lage signaal-ruisverhouding, lage aantallen en onvoldoende doeldetectie), afwijkende software-updates en procedurele problemen (bijvoorbeeld voortijdige beëindiging van verschillende stappen). Voor deze problemen wordt aanbevolen dat de gebruiker contact opneemt met de fabrikant voor ondersteuning op afstand. Als alternatief, als de gebruiker intrinsieke gegevensproblemen ondervindt (bijv. Laag aantal kernen in het algemeen, lage variabiliteit in expressie tussen ROI's), kan hij overwegen eerdere stappen in de procedure te herhalen (bijvoorbeeld het opnieuwpoolen van gegevens van de oorspronkelijke TMA, het herdefiniëren van ROI's). Het is ook belangrijk om variaties in weefseldichtheid te overwegen als een potentiële confounder van antigene productie en dus antilichaamexpressie; daarom moeten weefsels met vergelijkbare dichtheden ernaar streven te worden geselecteerd voor analyse.
Beheersmaatregelen zijn ingebouwd in het protocol. Het programma biedt zowel een interne positieve als negatieve controle die rekening houdt met variaties in hybridisatie van de PC-oligo's naar de fluorescerende barcodes. Huishoudelijke eiwitten bieden een andere positieve controle die bovendien kan dienen als een normalisatiefactor op basis van cellulariteit.
Het vermogen om ROIs te definiëren waarbinnen kwantificering plaatsvindt, is de basis van de ruimtelijke profileringscapaciteit van DSP. Deze aanpasbare afbakening van ROI's markeert een kritische en onderscheidende stap binnen het protocol. De optie om een ROI zo klein als een enkele cel te creëren, zorgt voor regionale precisie in eiwit- of nucleïnezuurkwantificering, en de mogelijkheid om meerdere ROI's te definiëren en hun inhoud tegelijkertijd te kwantificeren door middel van multiplexanalyse levert een high-throughput benadering op.
Wanneer ROIs worden geselecteerd om pathologisch verschillende regio's binnen een glioommonster weer te geven (bijv. Necrotisch, perivasculair), kunnen proteomische profilering en regionale vergelijking mechanismen van tumorvoortplanting en progressie onthullen. IHC is bijvoorbeeld gebruikt om de expressie van hypoxie-induceerbare factor (HIF-1α) regionaal te kwantificeren in glioblastoommonsters en heeft een hogere expressie in de buurt van necrotische gebieden onthuld in vergelijking met perivasculaire zones29. Dit komt overeen met verschillende studies die wijzen op een rol voor hypoxie in de tumorigenese van glioom.
Regionale variatie is ook op grote schaal bestudeerd onder immuuncelcomponenten van de tumormicro-omgeving. Macrofagen/microglia vormen de overheersende immuuncelpopulatie bij gliomen en zijn uitgebreid bestudeerd op regionale basis. Van subpopulaties van tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's) is aangetoond dat ze verschillende rollen spelen in tumorprogressie, afhankelijk van hun locatie in de tumor en micro-omgeving. Die binnen de invasieve rand van de tumor breken het keldermembraan af en bevorderen verspreiding; die in hypoxische gebieden oefenen een angiogeen effect uit en vergemakkelijken de groei; degenen in de nabijheid van tumor vasculatuur scheiden EGF en geassocieerde factoren af om stromale tumorcellen naar bloedvaten te leiden, waardoor metastasewordt veroorzaakt 30. Deze kritische, ruimtelijk afhankelijke eigenschappen tonen de waarde aan van regionale proteomische gegevens in de kankerbiologie en vertegenwoordigen een belangrijke aanvullende toepassing van DSP op de karakterisering van immuuncelpopulaties binnen een tumor en zijn micro-omgeving.
De techniek heeft een paar beperkingen, waaronder de kosten en het relatief kleine aantal doelen dat beschikbaar is in de kernantilichaampanelen. Bovendien, hoewel subcellulaire resolutie niet mogelijk is met DSP, zal het mogelijk zijn met aankomende nieuwe technologieën31. Ondanks deze beperkingen is DSP een krachtige techniek voor bepaalde soorten gerichte, voorheen onbeantwoordbare vragen in de glioomcelbiologie. Deze innovatieve technologie biedt een uitzonderlijke kans om nieuwe biologische perspectieven te ontdekken door middel van een nauwkeurige beoordeling van verschillende eiwitdoelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van het Laboratorium voor Klinische Genomica en Geavanceerde Technologie in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde van het Dartmouth Hitchcock Health System. De auteurs erkennen ook de Pathology Shared Resource in het Dartmouth Cancer Center met NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
