Summary
이 원고에서 우리는 말초 조직 공학에 사용하기 위해 그래핀을 함유하는 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 제조를 시연합니다. 이 3D 바이오 하이브리드 재료를 사용하여 줄기 세포의 신경 분화 프로토콜이 수행됩니다. 이것은 유사한 생체 재료를 클리닉에 가져 오는 중요한 단계가 될 수 있습니다.
Abstract
말초 신경 병증은 축삭 손상의 결과로 발생할 수 있으며 때로는 탈수 초성 질환으로 인해 발생할 수 있습니다. 말초 신경 손상은 응급 환자의 1.5%-5%에서 발생하는 세계적인 문제이며 상당한 실직으로 이어질 수 있습니다. 오늘날 스캐폴드, 적절한 세포주 및 생체 신호로 구성된 조직 공학 기반 접근 방식은 3차원(3D) 바이오프린팅 기술의 발전으로 더욱 적용 가능해졌습니다. 다양한 하이드로겔 생체 재료와 줄기 세포, 엑소좀 또는 생체 신호 분자의 조합은 말초 신경 재생의 기존 문제를 극복하기 위해 자주 연구되고 있습니다. 따라서, 하이드로겔과 같은 주사 가능한 시스템, 또는 다양한 바이오프린팅 방법에 의해 형성된 이식형 도관 구조의 생산은 말초 신경 공학에서 중요성을 얻고 있다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이들은 특수 세포는 아니지만 부상에 대한 반응으로 적절한 자극으로 분화 할 수 있습니다. 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 시장이라고 불리는 미세 환경의 영향을 받고 있습니다. 말초 신경 손상, 특히 신경망증에서 이 미세 환경은 절단된 신경 말단을 외과적으로 결합한 후에도 완전히 구출될 수 없습니다. 복합 생체 재료 및 결합 된 세포 치료 접근법은 생분해 성, 생체 적합성 및 가공성과 같은 다양한 특성 측면에서 재료의 기능성과 적용 가능성을 높입니다. 이에 본 연구는 그래핀 기반 바이오하이브리드 하이드로겔 패터닝의 제조 및 용도를 입증하고, 신경 재생에 효과적인 해결책이 될 수 있는 줄기세포의 신경세포로의 분화 효율을 알아보는 것을 목적으로 한다.
Introduction
유기체와 환경의 내부 구조를 연결하는 메커니즘 인 신경계는 중추 신경계와 말초 신경계의 두 부분으로 나뉩니다. 말초 신경 손상은 응급실에 내원하는 환자의 1.5%-5%를 차지하는 세계적인 문제이며 다양한 외상으로 인해 발생하여 상당한 실직을 초래합니다 1,2,3.
오늘날 말초 신경 공학에 대한 세포 접근법은 큰 관심을 끌고 있습니다. 줄기 세포는 이러한 접근법에 사용되는 세포 중 가장 먼저 나옵니다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이 세포들은 특수화되어 있지만, 손상에 대한 반응으로 적절한 자극에 의해 분화할 수 있다 4,5. 줄기 세포 가설에 따르면, 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 (stem cell niche)라고 불리는 미세 환경의 영향을받습니다. 줄기세포의 보존과 분화는 세포와 스캐폴드7를 이용한 조직공학을 통해 재구성될 수 있는 미세환경6의 존재 없이는 불가능하다. 조직 공학은 공학과 생물학 원리를 모두 포함하는 다학문 분야입니다. 조직공학은 생체 조직을 대체할 수 있는 인공 조직을 만들 수 있는 도구를 제공하며, 손상된 조직을 제거하고 기능성 조직을 제공함으로써 이러한 조직의 재생에 사용될 수 있다8. 조직 공학의 세 가지 초석 중 하나인 조직 스캐폴드는 천연 및 합성 재료와 다른 방법을 사용하여 생산된다9. 3차원(3D) 프린팅은 다양한 방법을 사용하여 복잡한 모양을 간단하지만 다재다능하게 생산하여 결함 조직을 대체하거나 복원하는 데 널리 사용되는 새로운 적층 제조 기술입니다. 바이오프린팅은 세포와 생체 재료의 공존을 가능하게 하는 적층 제조 방법으로, 바이오잉크(bioinks)라고 불린다 10. 신경 세포가 서로 상호 작용하는 것을 고려하여 연구는 그래핀과 같은 전도성 생체 재료 후보로 이동했습니다. 플렉시블 일렉트로닉스, 슈퍼 커패시터, 배터리, 광학, 전기화학 센서 및 에너지 저장과 같은 특성을 갖는 그래핀 나노플레이트는 조직 공학 분야에서 선호되는 생체 재료이다11. 그래핀은 손상된 조직과 장기의 증식과 재생이 수행된 연구에 사용되어 왔다12,13.
조직 공학은 스캐폴드, 세포 및 생체 신호 분자의 세 가지 기본 구성 요소로 구성됩니다. 말초 신경 손상에 대한 연구는이 세 가지 구조를 완전히 제공한다는 점에서 결함이 있습니다. 줄기 세포 또는 생체 신호 분자만을 포함하는 생체 재료, 줄기 세포 분화를 가능하게하는 생리 활성 분자의 부족, 사용 된 생체 재료의 생체 적합성 부족, 조직 틈새 세포의 증식에 대한 낮은 영향, 따라서 신경 전도가 완전히 실현되지 않습니다 2,13,14,15,16. 이를 위해서는 신경 재생의 최적화, 근육 위축(17,18)의 감소, 그리고 이러한 문제에 대한 성장 인자를 가진 필요한 귀환(19)을 생성해야 한다. 이 시점에서, 임상으로 이송 될 외과 생체 재료 프로토 타입의 신경 활성의 특성화 및 분석은 매우 중요합니다.
따라서이 방법 연구는 3D 바이오 프린터로 형성된 그래 핀 나노 플레이트를 사용한 바이오 잉크 하이드로 겔 패터닝과 그것이 포함하는 줄기 세포의 신경성 분화에 미치는 영향을 조사합니다. 또한, 그래핀이 신경구 형성 및 분화에 미치는 영향을 조사합니다.
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Protocol
1. 와튼젤리 중간엽 줄기세포의 배양
- Wharton's jelly mesenchymal stem cells(WJ-MSC, ATCC의 제품)를 -80°C 냉동고에서 꺼냅니다. Yurie et al.20에 기재된 바와 같이, 실온에서 멸균 층류에서 10% 태아 송아지 혈청(FBS), 1% Pen-Strep 및 1% L-글루타민을 함유하는 DMEM-F12 배지에서 WJ-MSC를 배양한다.
- 35% FBS, 55% DMEMF-12 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하는 동결 배지를 사용하여 일부 세포를 1 x 106 cells /mL로 냉동 보존합니다. 이를 위해 Thoma 세포 카운팅 슬라이드에서 1 x 106 세포를 계수하고 냉동 용액을 적가합니다. 슬라이드를 액체 질소 용기로 빠르게 옮깁니다.
- 배양된 세포가 플라스크에서 80% 합류하면 배지를 붓고 5mL의 PBS로 세척합니다. 5mL의 0.25% 트립신과 2.21mM EDTA-4Na를 추가합니다. 37°C의 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.
- 인큐베이터에서 꺼낸 세포에 10% FBS가 포함된 DMEM-F12 배지 10mL를 추가합니다. 잘 매달고 매체를 모으고 매체를 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 실온에서 5분 동안 101 x g 의 회전 속도로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 10% FBS를 함유한 신선한 영양 배지로 새 플라스크에 세포를 다시 시딩합니다.
참고: 형질도입 방법에 의해 GFP 유전자로 표지된 상업용 WJ-MSC는 생산될 생체 재료-세포 상호작용을 더 잘 시각화하는 데 사용할 수 있습니다21. 이 방법에서 사용할 그룹은 표 1과 같이 생성할 수 있습니다.
| 생성된 그룹 | 만드는 이유 | 담당자 수 | ||
| 2차원 WJ-MSC(2D-C) | 2D 제어 | 엑스 5 | ||
| 2D WJ-MSC 및 그래핀 (2D-G) | 2D에서 그래핀 독성 선량 측정 | x 서로 다른 농도로 5회 반복 | ||
| WJ-MSC는 바이오잉크(3D-B)에 포함되어 있습니다. | 3D 제어 | 엑스 3 | ||
| WJ-MSCs 및 0.1 % 그래 핀은 바이오 잉크 (3D-G)에 포함되어 있습니다. | 3D 그래핀-바이오잉크 바이오하이브리드 그룹 | 엑스 3 | ||
| WJ-MSC는 바이오잉크(3D-BS)에서 스페로이드 형태입니다. | 스페로이드 형태의 3D 제어 | 엑스 3 | ||
| 바이오잉크의 WJ-MSC 및 0.1% 그래핀 아레인 스페로이드 형태(3D-GS 그룹) | 3D 그래핀-바이오잉크 스페로이드 형태의 바이오하이브리드 그룹 | x3 | ||
| 3D 바이오잉크 드롭 | SEM 및 FTIR 특성화 분석을 위해 생산됩니다. | x5 | ||
| 3D 그래핀 드롭 | SEM 및 FTIR 특성화 분석을 위해 생산됩니다. | x5 | ||
| GFP 표지 WJ-MSCs & 0.1%를 함유한 3D 바이오잉크 | 적절한 용량의 그래핀을 함유한 바이오잉크에서 WJ-MsC의 움직임 관찰. | x3 | ||
표 1. 메서드의 그룹입니다. 메서드의 모든 2D 및 3D 그룹이 포함됩니다.
2. 그래핀 독성 및 2D 이미징
- 그래핀 농도의 제조 및 세포에의 적용
참고 : 원시 그래 핀 나노 입자는 상업적으로 구입되었으며 (산업용 그래 핀 나노 플레이트 유형) 기증되었습니다. 입자의 치수는 두께 5-8 nm, 직경 5 μm, 표면적 120-150m2/g이었다.- 그래핀의 무게를 측정하여 1% 용액(mg/mL)을 만듭니다. 100μg의 그래핀 나노입자에 10% FBS가 포함된 DMEMF-12 배지 10mL를 첨가하여 원액을 만들고 이 용액을 원액으로 라벨링합니다. 오토클레이브에서 121°C의 1.5기압 압력으로 20분 동안 살균합니다.
알림: 멸균 그래핀 혼합물은 사용할 때까지 4°C의 냉장고에 보관됩니다. 장기간 사용(최대 1개월)에는 적합하지 않을 수 있습니다. 이 경우 혼합물을 재구성하고 멸균해야합니다. - 무독성 용량을 결정하기 위해 다양한 농도의 중간 그래핀 혼합물을 준비합니다. 초기 희석액을 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 및 0.0001% 그래핀/매체로 설정합니다.
- 1% 원액으로 시작하여 각 농도에서 1mL를 연속적으로 취하여 새 튜브로 옮깁니다. 10% FBS가 함유된 DMEMF-12 배지 9mL를 각 튜브에 추가하여 점진적으로 희석된 5개의 샘플을 만들고 용액을 흔들고 소용돌이쳐 균등하게 분배합니다. 대조군으로 10% FBS가 있는 DMEMF-12 배지 10mL만 사용하십시오.
참고: 그래핀의 무거운 플레이크는 침전되므로 재분배되어야 합니다. - WJ-MSC를 웰당 5 x 105 세포 에서 10% FBS를 함유하는 2mL의 신선한 배지와 함께 6웰 플레이트에 시딩합니다. 37°C에서 1일 동안 배양한다. 그런 다음 판을 동일하고 반복되는 우물 그룹으로 나눕니다. 각 농도에 대해 5 회 반복하십시오.
- 배지를 폐기한 다음 배지를 웰당 2mL의 그래핀 배지 농도로 교체합니다. 대조군에 대해서는 배지만 사용하십시오. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
- 그래핀의 무게를 측정하여 1% 용액(mg/mL)을 만듭니다. 100μg의 그래핀 나노입자에 10% FBS가 포함된 DMEMF-12 배지 10mL를 첨가하여 원액을 만들고 이 용액을 원액으로 라벨링합니다. 오토클레이브에서 121°C의 1.5기압 압력으로 20분 동안 살균합니다.
- MTT를 이용한 그래핀의 무독성 농도 측정
- 24시간 후에 그래핀으로 배지를 폐기합니다. PBS로 각 우물을 씻으십시오. 웰당 2mL의 10% FBS가 있는 신선한 DMEMF-12 배지를 추가합니다.
참고: 세포내이입에 의해 세포 내로 흡수되지 않는 그래핀 나노입자가 환경에서 제거되기 때문에 세포에 그래핀 농도를 적용한 후 PBS로 세척하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 MTT 테스트가 더 효율적입니다. - MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드) 프로토콜을 사용하여 Kose et al.22 및 단계 2.2.3.-2.2.6에 설명된 대로 50% 세포 생존율을 나타내는 IC50 값을 결정합니다.
- 먼저 MTT 염 5mg/mL의 무게를 측정하고 PBS에 녹입니다. 0.45μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 15mL 원심분리기 튜브에서 만든 MTT 용액을 알루미늄 호일로 싸서 4°C에서 보관합니다.
- 10 μL의 MTT를 모든 웰에 첨가하고 플레이트를 37°C에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후 현미경으로 10x 배율로 포르마잔 결정의 형성을 관찰합니다.
- 세포에 형성된 결정을 용해시키기 위해 100 μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하고 피펫팅으로 혼합한다. 접시를 실온에서 30분 동안 어두운 곳에 두십시오. 플레이트를 ELISA 플레이트 리더에 삽입합니다. 흡광도 측정을 위해 프로그램에서 파장을 570nm로 설정하고 플레이트(22)를 읽게 합니다.
참고: 또한, 그래핀 입자 단독은 270nm(23)에서 판독되는 반면, 여기서 570nm(24 )의 판독 범위는 세포 생존율만을 판독하기 위한 것이다. - 통계 분석 프로그램에서 Tukey의 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 얻은 결과에 대한 통계 분석을 수행합니다.
- 24시간 후에 그래핀으로 배지를 폐기합니다. PBS로 각 우물을 씻으십시오. 웰당 2mL의 10% FBS가 있는 신선한 DMEMF-12 배지를 추가합니다.
- 스티치 이미징
- 서로 다른 그래핀 농도와 세포의 상호 작용을 검사하려면 스티치 이미징(stitch imaging)이라는 방법으로 세포의 타임랩스를 수행합니다. 이 방법은 현미경으로 일정한 간격으로 촬영한 이미지 샘플을 사용하여 타임랩스 이미지를 생성합니다.
- 이렇게하려면 먼저 컴퓨터를 켭니다. 타임랩스 이미징 인큐베이터를 켜고 37°C로 설정합니다. MTT 플레이트를 타임랩스 인큐베이터 슬롯에 놓습니다.
- 컴퓨터에서 Stitch 프로그램을 엽니 다. 시스템에서 읽을 웰을 지정합니다. 판독기를 첫 번째 우물로 가져가 백색광에서 10배 배율로 해당 영역을 찾아 초점을 맞춥니다. 프로그램을 시작합니다.
참고 : 고품질 4 행 x 5 열 다중 사진 콜라주를 만드는 프로그램입니다. 이 프로그램은 HD 화질로 차례로 찍은 사진을 결합합니다. 시스템 시작 버튼을 누르면 웰이 자동으로 읽히고 4 행 x 5 열 여러 장의 사진을 찍고 꿰매십시오.
3. 그래핀 - 바이오잉크 바이오하이브리드 하이드로겔 생산 및 WJ-MSCs 분화
- 바이오잉크 생산
참고: 동결건조된 상업적으로 이용 가능한 알지네이트-젤라틴(3:5) 분말은 바이오잉크의 기초로 사용됩니다. 그래핀 바이오잉크군(3D-G; 3D-GS)과 그래핀이 없는 대조군 바이오잉크군(3D-B; 3D-BS)은 동일한 방법으로 제조된다(표 1).- 준비를 위해 50mL 원뿔형 튜브를 사용하십시오. 먼저 알긴산 4.5mg과 젤라틴 1.5mg을 달아 원심분리관으로 옮긴다. 10% FBS를 함유하는 DMEMF-12 배지를 혼합물에 총 부피 50 mL로 첨가한다. 이것은 그래핀이 없는 대조군(C)군이다.
- 알긴산 4.5mg과 젤라틴 1.5mg의 무게를 반복하고 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 2.1.3 단계에서 제조된 0.1% 그래핀 50μL를 취한다. 튜브에 추가하십시오. 10% FBS가 포함된 DMEMF-12를 총 부피 50mL에 추가합니다.
- 바이오잉크를 먼저 피펫팅(pipetting)으로 혼합한 다음 소용돌이(vortex)로 혼합합니다. 오토클레이브에서 121°C의 1.5기압 압력으로 20분 동안 살균합니다. 또는 끓는점까지 전자레인지에 돌려 살균을 수행하십시오.
- 혼합물을 고압 증기 멸균 한 후, 실온에서 2 분 동안 280 x g 에서 원심 분리하여 형성된 기포를 제거한다. 세포가 준비될 때까지 바이오잉크를 37°C에서 보관합니다.
- WJ-MSC 및 3D 바이오프린팅 추가
- 계수를 위해, 대략 5 mL의 PBS와 80% 합류가 있을 때 세포를 세척하고, 5 mL의 0.25% 트립신 및 2.21 mM EDTA 4Na를 첨가한다. 37°C에서 5분간 방치한다.
- 인큐베이터에서 꺼낸 후 10% FBS가 함유된 DMEM-F12 배지 10mL를 세포에 첨가한다. 잘 매달고 매체를 모아 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 101 x g 로 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
- 펠릿과 함께 약 250 μL의 배지를 남겨 둡니다. 펠릿을 1mL의 신선한 배지에 재용해합니다. 48 μL의 배지에 2 μL의 세포 현탁액과 50 μL의 트리판 블루(0.4 g 트리판 블루/100 mL)를 원뿔형 튜브(1.5 mL)에 넣어 계수합니다4. 잘 피펫팅하십시오.
- 제조된 염색된 세포 현탁액 약 10mL를 토마 세포 계수 챔버에 첨가한다. 광학 현미경의 양쪽에 있는 사각형에 떨어지는 평균 세포 수를 계산합니다.
활력 백분율(%) = (계수된 생존 세포/계수된 총 세포) x 100 계산
참고 : 세포 - 바이오 잉크 상호 작용은 두 가지 방법으로 연구됩니다 : (1) 바이오 잉크 (3D-B; 3D-G)에 추가하여 인쇄 할 수 있습니다. (2) 세포를 압착 한 후 바이오 잉크에 시딩하고 세포는 스페로이드 (3D-BS, 3D-GS)를 형성합니다. - 세포-바이오잉크 상호작용을 위해 먼저 바이오잉크 그룹을 생성한다(표 1). 그룹 1에는 바이오프린팅을 위해 바이오잉크로 인쇄된 3D-B 및 3D-G가 포함됩니다. 그룹 2에는 바이오프린팅 후 스페로이드가 형성된 3D-BS 및 3D-GS 바이오잉크가 포함됩니다.
- 0.5mL의 배지에 약 1 x 107 개의 세포가 있도록 그룹 1의 세포를 계산합니다. 바이오잉크 4.5mL를 넣어 총 부피를 5mL로 만듭니다. 주사기를 사용하여 멸균 캐비닛의 카트리지로 옮깁니다. 바이오프린터의 해당 압출기 섹션에 카트리지를 설치합니다.
- 두 번째 그룹의 경우 각 바이오 잉크 그룹에서 5mL를 가져 와서 인젝터를 사용하여 멸균 카트리지로 옮깁니다.
- 두 개의 동축 프린트 헤드와 공압 구동 압출 기술이 있는 바이오프린터를 사용하십시오. 마이크로스텝당 X/Y/Z 분해능을 1.25μm, 압출 폭을 400μm, 압출 높이를 200μm로 설정합니다. 20mm x 20mm x 5mm 그리드는 3D 바이오프린팅 작업에 가장 많이 사용되는 3D 모델 중 하나입니다.
- 오픈 소스 웹 기반 CAD 프로그램을 사용하여 3D 모델을 만듭니다. 바이오프린팅을 하기 전에 오픈 소스 플랫폼(예: infill) 중 하나를 사용하여 간단한 3D 모델을 만듭니다. 모델은 선형(여기에 사용된 모델과 같은), 벌집 모양 또는 그리드 모양일 수 있습니다. 5mm x 20mm x 20mm 정사각형을 만든 후 .stl 형식으로 내보내고 다운로드합니다.
- 바이오 프린터 소프트웨어는 .stl 파일을 사용하고 슬라이서 모듈을 사용하여 인쇄 가능한 .gcode 형식으로 변환합니다. 인쇄 가능한 그리드 모양을 얻으려면 슬라이서 모듈에서 외부 셸을 사용하지 않도록 설정합니다. 작동하기 전에 70% 에탄올로 장치를 닦은 다음 UV 살균으로 살균하십시오.
- 바이오프린팅 공정의 경우 인젝터를 사용하여 바이오잉크 그룹을 카트리지로 옮깁니다. 바이오프린터의 해당 압출기 섹션에 카트리지를 설치합니다.
- 3D 프린터의 평균 압력을 7.5psi로 설정하고 카트리지 및 베드 온도를 37°C로 설정합니다. 속도를 60%로 설정하고 표준 3D 프린팅 프로세스를 수행합니다.
참고: 공간(예: 선형 모델)으로 준비된 모델을 계획하면 바이오프린팅 후 공간에서 세포 배양을 수행할 수 있습니다. - 쓰기 단계에서 시스템을 홈 위치에 놓습니다. 축(X, Y, Z)을 자동으로 배치하고 압출기를 선택한 다음 설정합니다. 인쇄 프로세스를 시작합니다. 바이오프린팅 과정이 끝나면 샘플을 채취하여 층류 캐비닛 아래에 놓습니다.
- 인쇄 후 바이오잉크에 0.1NCaCl2 용액을 분무하거나 실온에서 피펫으로 용액 1mL를 추가합니다. 약 10-20초 동안 기다렸다가 인쇄된 패턴을 Ca 2+ 및 Mg2+가 포함된 PBS로 2배 세척합니다.
- 각 세포 함유 바이오잉크 그룹 위에 10% FBS 배지가 있는 DMEMF-12 2mL를 추가합니다. 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C에서 인큐베이션한다. 그 후, 스페로이드 형성을 위해 1 x 106 세포가 포함된 현탁 배지 2mL를 각 그룹에 추가합니다.
- 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C에서 인큐베이션한다. 24시간 배양 후 도립 현미경으로 스페로이드 형성을 관찰합니다.
- 뉴런 유사 세포로의 WJ-MSC 분화
- 배양 24시간 후 모든 바이오잉크 배치를 관찰하고 사진을 찍습니다. 웰당 신경성 분화 배지 2mL를 추가하고(대조군 제외) 2일마다 새로 고칩니다. 신경 분화를 관찰하기 위해 7일 동안 추적합니다.
4. 그래핀-바이오잉크 바이오하이브리드 하이드로겔 특성 분석
참고: 그래핀-바이오잉크 바이오하이브리드 하이드로겔의 특성화를 위해 타임랩스 이미징, 푸리에 변환 적외선 분광법(FT/IR) 및 주사전자현미경(SEM) 분석이 수행됩니다. 샘플은 FT/IR 및 SEM 분석을 위한 드립 방식으로 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 그룹에서 생성됩니다.
- FT/IR 분석
참고: FT/IR은 수학적 푸리에 변환을 기반으로 하는 화학 분석 방법으로 재료 특성화에 없어서는 안 될 필수 요소입니다. 할로겐 램프, 수냉식 수은 광원, 신호 종횡비 4cm-1, 2,200cm-1에서 1분 동안 측정된 28°C Michelson 간섭계 원리를 기반으로 하는 FT/IR 장치를 사용하십시오.- FT/IR 현미경을 준비하고 기기의 광학 장치가 정렬되어 있는지 확인합니다. 장치를 보정합니다.
- 샘플이 한 방울에 있기 때문에 1-2mm 두께의 하이드로 겔 조각을 가져 와서 샘플 부분에 집게로 놓습니다. 샘플에 초점을 맞추고 밀접하게 접촉할 때까지 올립니다. 시스템에서 프로세스를 시작하여 샘플 스펙트럼을 수집합니다.
- 주사전자현미경(SEM) 분석
참고: 표면 형태, 내부 구조, 세포 분포 및 바이오잉크-세포 상호 작용은 SEM 분석을 통해 다양한 차원에서 검사할 수 있습니다.- 피펫 팁 액적 방법을 사용하여 1mL의CaCl2 가교제가 들어 있는 6웰 플레이트에 하이드로겔을 떨어뜨립니다( 그림 1 참조).
- 플레이트를 약 1 mL의 PBS로 2x 세척하여 염 용액을 유리화시킨다. 그런 다음 집게를 사용하여 5mL의 5% 파라포름알데히드가 들어 있는 팔콘 튜브에 이 방울을 넣습니다.
- 메스의 도움으로 드롭 바이오 잉크에서 얇은 섹션을 만듭니다. 금속판의 끈적끈적한 면에 샘플을 붙입니다. 공기를 아르곤 가스로 대체하여 플라즈마 상으로 통과하는 금 팔라듐이 샘플을 덮는 코팅 장치에 삽입합니다.
- 전자 현미경 (SEM)에 넣으십시오. SEM이 연결된 현미경 프로그램을 엽니다. 스케일링을 수행하고 샘플의 다른 부분의 이미지를 찍습니다. 이 프로토콜에는 5μm, 10μm 및 200μm 스케일이 사용되었습니다. 3D-B 및 3D-G 그룹에 대해 총 40개의 이미지가 촬영되었습니다.
- 타임랩스 이미징
참고: 타임랩스 이미징 중에 GFP 유전자 형질전환 세포가 포함된 바이오잉크 샘플뿐만 아니라 스페로이드가 있는 바이오잉크도 16시간 동안 이미징되었습니다. 타임랩스 이미징은 줄기 세포에 대한 그래핀의 영향을 조사하고 바이오잉크 내의 세포 상호 작용을 모니터링하기 위해 수행됩니다.- 3.2.11 단계에서와 같이 상업적으로 이용 가능한 1 x 107 GFP 표지 MSC를 5mL의 바이오잉크 및 바이오프린트에 추가합니다. 가교제 1mL를 넣고 20-30초 동안 유지한 다음 PBS로 2배 세척합니다.
- 타임랩스 모니터를 켜고 컴퓨터에서 프로그램을 엽니다. 타임랩스 모드에서 약 16시간을 설정하고 온도를 37°C로 설정합니다. 시작 버튼을 누릅니다. 40초 타임랩스 비디오 샘플 형태의 비디오가 시스템에 의해 녹화됩니다.
- 현미경의 초점을 2시간마다 10배 배율로 맞춥니다. 또한 동일한 단계에 따라 생성된 스페로이드를 시각화합니다.
그림 1: 특성화에 사용하기 위해 방울로 생성된 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 그룹. (A) 가교제가 있는 플레이트의 바이오잉크 샘플(사전 특성화 이미지). (B) 바이오잉크의 3D-B 드롭 이미지. (C) 3D-G 바이오잉크 드롭 이미지. 특성화 할 생체 재료와 포함 된 세포는 금도금, 샘플링 등과 같은 공정을보다 쉽게 거칠 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 면역염색법에 의한 신경성 분화 확인
- 구체 형태를 방해하지 않고 스페로이드를 수집하고 조직 절편을 위해 파라핀을 매립하는 대신 더 쉬운 방법으로 염색하기 위해 새 플레이트에 다시 시딩합니다.
- 48웰 플레이트를 약 20mL의 사전 오토클레이브 0.1% 젤라틴 용액으로 덮고 최소 1시간 동안 인큐베이터에 보관합니다. 약 500 μL의 준비된 0.1% 젤라틴을 48웰 플레이트에 피펫팅합니다. 젤라틴 플레이트를 인큐베이터에 10 분 동안 그대로 두십시오.
알림: 이렇게 하면 젤라틴이 약간 부풀어 올라 표면을 덮고 수집된 스페로이드가 부착될 수 있는 더 나은 환경을 만들 수 있습니다. - 피펫팅으로 스페로이드를 수집하고, 인큐베이터에서 수집된 스페로이드를 48웰 플레이트의 웰에 분배하고, 새로운 배지를 추가합니다. 그런 다음 12-24시간 동안 배양합니다.
참고: 스페로이드를 세어 분배하는 것은 매우 어렵습니다. 단일 튜브에 스페로이드를 수집하고 전체 부피를 웰에 고르게 분배합니다. 이 연구를 위해 각 웰에는 약 4-6개의 스페로이드가 포함되어 있습니다.
참고: 2D 샘플의 경우 사전 염색 세척으로 충분하며 매체 교체가 필요하지 않습니다. - 배지를 제거하고 스페로이드가 맨 위에 오면 PBS로 세포를 천천히 세척합니다. 4 시간 동안 2 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.
- 샘플을 PBS로 다시 세척하고 약 10mL의 2% BSA 및 0.1% TritonX로 30분 동안 차단합니다. 그런 다음 PBS 3x로 세척하십시오.
- 선택된 프라이머 항체(N-cadherin-rabbit 및 β-III tubulin-mouse)를 항체 희석제 시약 용액으로 1:100 비율로 희석합니다. 각 샘플에 100μL의 항체 용액을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 샘플을 PBS로 3배 세척한다. β-III 튜불린에 대한 항-마우스 IgG-FTIC-토끼 및 N-Cad에 대한 항-마우스 IgG-SC2781-염소 2차 항체와 함께 실온에서 30분 동안 1:200으로 희석하여 배양합니다. 어둠 속에서 모든 작업을 수행하십시오.
참고: 이중 염색에서 1차 항체(예: 마우스)로 사용되는 균주가 무엇이든 2차 항체에는 다른 균주(예: 염소 또는 토끼)를 사용해야 합니다. - PBS 3x로 2차 항체를 세척한 다음 DAPI 용액(1:1)을 각 샘플에 떨어뜨립니다. 15-20분 동안 기다립니다. 면역형광 이미징을 수행합니다.
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Representative Results
그래핀 독성 및 2D 이미징
얻어진 MTT 결과의 통계분석은 통계분석 소프트웨어에서 Tukey's test를 이용한 one-way ANOVA로 진행하였으며, 얻어진 그래프는 도 2에 나타내었다. 대조군에 비해 그래핀 백분율은 0.001% 그래핀 농도에 대해서만 유의한 감소를 보였다(**p < 0.01). 다른 군과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다(p > 0.05). 따라서 최적의 그래핀 농도는 0.1%로 측정되었는데, 이는 MTT 테스트 결과 및 스티칭 이미지에 따라 이 농도에 노출된 후 가장 높은 생존율이 관찰되었기 때문이다.
그림 2: 그래핀 농도가 세포 증식에 미치는 영향에 대한 조사. 대조군에 비해 그래핀 백분율은 0.001% 그래핀 농도에 대해서만 유의한 감소를 보였다(**p < 0.01, n=6). 다른 군과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다(p > 0.05; n=6). 얻어진 MTT 결과의 통계분석은 통계분석 소프트웨어에서 Tukey's test와 함께 one-way ANOVA로 진행하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 수치는28에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
제시된 방법의 이 부분은 줄기 세포-그래핀 상호작용이 향후 연구에 사용될 수 있음을 보여줍니다. 테스트된 각 농도에서 그래핀은 2D 시스템에서 내성이 있었고 엔도사이토시스를 통해 세포에 흡수되는 것이 관찰되었습니다(그림 3). 그래핀 플레이트는 세포 내부의 세포질을 따라 이동하는 것으로 확인되었습니다.
그림 3: 세포-그래핀 상호 작용은 스티칭된 이미지에서 2차원으로 표시됩니다. (a) 제어; (B) 0.0001%; (C) 0.001%; (D) 0.01%; (E) 0.1%; 및 (f) 1% 농도의 그래핀. 타임랩스 이미징과 고화질 품질 설정을 결합하여 여러 사진의 4행 x 5열 콜라주를 얻습니다. 이 수치는 28에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
또한, 본 연구에서는 그래핀-바이오잉크 효과가 3D 시스템에서 어떠한 독성 미세환경도 생성하지 않고 세포가 상호작용하는 것으로 관찰되었다.
또한 3D 시스템에서 그래핀을 사용해도 독성 미세 환경이 생성되지 않는 것으로 관찰되었습니다. 세포에 대한 독성 선량을 결정하는 것은 장기 도관 임플란트 또는 주사 가능한 하이드로겔 형태에서 그래핀을 사용하는 데 중요합니다. 또한, 그래핀은 뉴런 커뮤니케이션에 효과적인 물질이기 때문에, 문헌25에 기록된 바와 같이 신경 조직 공학 응용에서의 그래핀의 사용이 널리 증가하였다.
복합 바이오 소재 및 3D 바이오프린팅 생산
젤라틴-알지네이트 기반 바이오잉크 바이오하이브리드 패터닝의 형성은 무독성 농도의 그래핀(0.1%)으로 수행하였다. 선택된 적절한 용량의 그래핀이 바이오잉크 내의 세포와 상호작용하는 것이 관찰되었다.
타임랩스 이미징
GFP 샘플은 타임랩스에서 약 16시간 동안 37°C로 설정되고 사진과 비디오가 촬영되었습니다(비디오 1). GFP 신호는 세포 사멸이 관찰되었을 때 손실되었습니다. 여기서, 3D 그래핀 배지에서 생존한 세포는 배양이 끝날 때까지 GFP 밝기가 관찰되었기 때문에 생명력을 유지하는 것으로 검출되었다.
동영상 1. GFP 표지 WJ-MSC의 타임랩스 비디오. 표지 된 줄기 세포가 서로 상호 작용하는 것이 관찰됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그래핀-바이오잉크 바이오하이브리드 하이드로겔 특성 분석
SEM 및 FT/IR은 드롭 바이오잉크 방법으로 생성된 3D-B 및 3D-G 그룹의 특성화에 사용되었습니다. 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 그룹의 SEM 이미지는 그림 4에 나와 있습니다. 4.2.5단계에서 촬영한 40개의 이미지 중 4개의 대표 이미지가 여기에 표시됩니다.
그림 4: 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 그룹의 SEM 이미지. (A) 전자 현미경을 사용한 금 코팅된 3D-B 바이오잉크 섹션의 이미지. 스케일 바: 200μm. (B) 3D-B 바이오잉크 내부 표면에 부착된 MSC의 이미지. 스케일 바: 5 μm (C) 3D-G 바이오잉크 내부 및 외부 표면의 이미지. 스케일 바: 200μm.(D) 내부 표면 셀 3D-G 바이오잉크 접착 이미지. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
따라서, 바이오 잉크 - 세포 상호 작용은 표면과 내부 모두에서 입증되었다. 두 바이오잉크(3D-B; 3D-G)에서 세포-생체재료 상호작용이 있었습니다. 세포는 형태학적으로 둥글고 물질에 부착되었습니다. 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 드롭의 FT/IR 분석을 그림 5의 그래프와 비교했습니다.
그림 5: FT/IR 분석. (A) 3D-B 바이오잉크. (B) 3D-G 바이오잉크. 1633.41 cm-1, 1552.42 cm-1 및 1033 cm-1과 같은 피크는 문헌26의 알지네이트-젤라틴 기반 하이드로겔 연구에서 발견되었습니다. 또한, 1335.46 cm-1 피크는 그래핀 생체 재료 연구27에서 볼 수 있는 피크와 유사하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대조군 바이오잉크(3D-B)는 알지네이트/젤라틴을 기반으로 했기 때문에 가장 두드러진 피크는 약 1633.41 cm-1, 1552.42 cm-1 및 1033 cm-1 1 1546 cm-1 26에서 피크가 관찰된 문헌의 유사한 연구와 비교됩니다. 그래핀 그룹(3D-G)에서 1399cm-1의 피크가 관찰되었고, 그래핀27로 수행된 연구에서 1335.46cm-1에서 유사한 피크가 발견되었습니다.
3D 신경 분화
분화 후 7일째 되는 날의 바이오잉크에 있는 스페로이드의 이미지는 그림 6에 나와 있습니다.
그림 6: 분화 후 7일째 대조군 WJ-MSC 및 스페로이드 그룹 샘플 의 2D 이미지. (A) 직경이 160μm 및 200μm인 3D-BS 그룹 바이오잉크의 구체 크기. (B) 2D 대조군 세포. (C) 3D-BS 그룹 및 (D) 3D-GS 그룹의 스페로이드. (D)의 검은색 물질은 스페로이드와 통합된 그래핀 분자입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세포는 2D 및 3D 배양 모두에서 활력을 유지하는 것으로 나타났습니다. 두 그룹(3D-B 및 3D-G)의 스페로이드 세포의 경계는 투명하고 활기차고 그래핀 그룹의 스페로이드는 상대적으로 더 커서 셀 내부에 그래핀을 갇힌 것으로 간주되었습니다. 분화는 또한 면역염색에 의해 시험되었다. 여기에 사용된 이중 염색을 사용하여 2D 신경 변형에서 세포의 활성을 3D 배양과 비교했습니다(그림 7).
그림 7: 2D 및 3D 세포의 면역염색. (A,B) 3D-BS 바이오잉크에서 배양된 스페로이드의 면역염색. (C,D) 3D-GS 바이오잉크 스페로이드 면역염색. (E) 차별화된 2D 양성 대조군 WJ-MSC. (F) 미분화 2D 음성 대조군 WJ-MSC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
7일 동안 배양한 세포의 면역형광 이미지를 도 7에 나타내었다. 샘플은 N-cadherin(녹색) 및 β-III 튜불린(빨간색)에 특이적인 항체로 염색되었습니다. 또한 DAPI는 핵(파란색 또는 보라색)의 시각화에 사용되었습니다. 따라서 2D 및 3D 샘플에 사용된 N-cadherins(녹색)는 신호 전달 메커니즘과 뉴런 발달에 중요한 역할을 하기 때문에 7일 동안 달랐습니다. 그림 7A-E의 녹색 이미지는 뉴런 유사 구조를 나타냅니다(그림 7). Class III β-튜불린은 인간 게놈에서 뉴런 마커로 알려진 7가지 이소타입 중 하나입니다. N-cadherin 발현은 β-III 튜불린에 비해 7일 동안 분화된 샘플에서 더 높은 것으로 나타났습니다. 본 실험의 결과에 따르면, 3D 시스템은 세포가 생존하고 분화하기에 더 적합한 미세 환경을 만들었다는 것이 확립되었습니다. 2D 양성 대조군 샘플(그림 7E)은 3D 샘플에 비해 더 적은 뉴런 유사 구조 마커를 발현했습니다(그림 7A-D). 이는 3D 구조로 만들어진 미세환경이 줄기세포의 분화에 더 효과적이라는 것을 보여준다. 또한, 세포 치료 단독; 생체 재료-세포 복합 치료는 신경 손상에 더 영향력 있고 효과적인 것으로 보입니다.
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Discussion
기존의 2D 방법에 비해 엔지니어링된 3D 스캐폴드로 적용된 처리의 이점은 날이 갈수록 두드러지고 있습니다. 이러한 치료법에 단독으로 사용되거나 생체 적합성 및 생분해성이 낮은 다양한 생체 재료로 생성된 스캐폴드와 함께 사용되는 줄기 세포는 일반적으로 말초 신경 재생에 부적절합니다. 와튼젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSCs)는 특히 획득 프로토콜의 최적화, 증식 능력 및 분화 능력을 고려할 때 적합한 후보 세포주인 것으로 보인다29. 이 연구에서 우리는 2D 및 3D 배양 모두에서 줄기 세포와 그래핀의 상호 작용을 조사했습니다. 또한 생성된 바이오하이브리드 하이드로겔 그룹의 신경성 분화를 2D 환경과 비교했습니다. 우리는 면역염색을 통해 바이오잉크의 신경구 형성을 입증했습니다. 추가 연구에서 우리는 SEM 및 FT/IR 방법으로 신경 채널로 주입 또는 이식할 수 있는 후보 프로토타입을 특성화했습니다. 이 연구는 생산된 생체 재료의 특성, 세포-생체 재료 상호 작용 및 생체 재료의 존재 하에서 줄기 세포의 신경 분화를 특징으로 합니다. 다음 단계에서는 마이그레이션에 미치는 영향을 조사합니다.
2개 이상의 생체적합성 재료를 조합하여 형성된 바이오하이브리드 재료는 균질한 재료(30)에 비해 구조적 특성 측면에서 더욱 유리해지고 있다. 이전 연구에서는 폴리글리콜산 기반 신경관 채널을 안면 말초 신경에 이식했습니다. 표지된 후각 줄기 세포를 이 도관에 삽입하여 말초 수술과 주입된 줄기 세포 요법의 성공적인 재생을 가져왔다16. 또 다른 연구에서는 불활성 특징으로 인해 문헌에서 자주 사용되는 인간 정상 진피 섬유아세포와 규소 신경관을 사용하여 개발된 다중 세포 스페로이드에서 얻은 3D 구조의 효과를 좌골 신경 손상의 재생에서 비교했습니다. 스페로이드 기반 3D 구조는 균질한 물질에 비해 좌골 손상이 있는 동물 모델에서 조직 재생을 훨씬 더 빠르게 증가시키는 것으로 나타났습니다20. 그러나, 문헌에서 자주 사용되는 실리콘계 생체 재료는 높은 감염 위험과 낮은 생체 적합성과 같은 몇 가지 중요한 단점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다15,30.
본 연구에서는 신경전도에 효과가 있는 것으로 알려진 그래핀 나노혈소판을 이용한 생체적합성 생분해성 하이드로겔 바이오하이브리드 복합조직의 제작을 3D 프린팅 기법으로 수행하였다. 그래핀이 신경전도를 위한 생체재료로 사용되었다는 다양한 연구가 있다25,30. 또한, 그래핀은 가장 얇고 가벼운 물질 중 하나이며, 이는 건강 기술에서 그래핀의 선호도를 높인다13. 생체 재료의 가장 바람직한 특성 중 하나는 생분해성입니다. 그래핀과 그 유도체의 생분해를 조사하기 위해 실험 및 분자 시뮬레이션 기술이 적용되었다13. 이 시점에서, 표면 개질-기능화 또는 복합 바이오 재료의 형태로의 제조는 주로 첨가제의 특성에 따라 생분해를 개선하거나 억제할 수 있다.
망간 과산화효소(MnP), 양고추냉이 과산화효소(HRP) 및 골수과산화효소(MPO)와 같은 다양한 효소가 그래핀 유도체의 생분해에 대한 문헌에서 이용 가능합니다. 이물질 부위에 와서 식균 작용을 수행하는 호중구에서 방출되는 과산화 효소 인 MPO 효소는 특히 인간의 폐에서 그래 핀 생분해와 관련이 있습니다13. 그래핀 나노튜브 대신 그래핀을 함유한 복합 생체 재료의 생분해성 수준은 서로 다릅니다. 복합 재료에서 원하는 특성을 얻는 것이 더 쉽습니다. 또한, 그래핀의 독성 투여량을 결정하는 것은 임상적으로 적용 가능한 생체 재료의 사용에 기여한다13.
프로토콜의 그래핀 단계에서 중요한 부분은 그래핀이 사용될 때 살균하는 것입니다. 바이오하이브리드-세포 상호작용 단계에서 발생할 수 있는 오염의 위험은 피할 수 있습니다.
얻어진 바이오하이브리드 그래핀-바이오잉크 하이드로겔 패터닝이 신경 분화에 미치는 영향을 조사한 결과, 3D 시스템에서 분화가 더 높다는 문헌과 양립할 수 있었다. 말초신경 손상 등 다양한 신경퇴행성 질환에 대항할 수 있는 조직공학적 세포기반 치료제 개발의 필요성이 나날이 높아지고 있으며, 현재 치료법의 부적절함이 나날이 높아지고 있어 본 연구의 중요성이 강조되고 있다.
이전 연구에서, 2D 세포 배양 배지에서 그래핀과 세포의 상호작용을 조사하였다28. 거기에서 얻은 경험을 바탕으로 알지네이트-젤라틴 바이오잉크에 알려진 비율로 그래핀을 첨가하고 3D 프린팅 방식으로 새롭고 독특한 생체 재료 프로토타입을 제작했습니다. 이 새로운 물질은 두 가지 다른 방식으로 세포 상호 작용을 연구하는 데 사용되었습니다. 첫 번째는 3D 프린터에서 세포-복합 생체 재료를 공동 인쇄하는 것입니다. 두 번째는 생체 재료로부터 세포 스페로이드의 형성입니다. 또한, 태그된 GFP 유전자를 함유하는 WJ-MSCs와 상기 물질의 상호작용도 관찰되었다.
이 연구에서 바이오하이브리드 바이오잉크는 FTIR 및 SEM 방법을 선택하여 특성화되었습니다. 이를 통해 물방울 방법으로 형성된 샘플 볼을 특성화 단계에서 검사할 수 있습니다. 특히 SEM 금도금 단계에서 단단하고 건조한 구조를 검사할 수 있기 때문에 SEM은 이 방법으로 만든 바이오잉크 볼에서 메스로 더 좋고 얇은 부분을 얻을 수 있는 물리적 적합성을 제공합니다.
이 방법 연구에서, 세포는 실험 중에 두 가지 다른 방식으로 바이오 하이브리드 재료에 첨가되었습니다 : 3D 바이오 프린팅을위한 내부 또는 스페로이드 형성 중. 바이오잉크로 세포를 덮고 3D 바이오프린터를 사용하면 연구자들이 신경 재생을 위해 원하는 3D 모양을 만들 수 있습니다. 반면에, 인쇄 압력으로 인해 세포에 더 많은 스트레스를 유발하여 세포 생존력을 상실합니다. 그러나 재생을 유도하기 위해 특정 부위에 주입하거나 이식할 때 세포 귀환을 증가시키는 것이 더 바람직한 방법일 수 있습니다.
바이오잉크에 스페로이드를 생성하면 세포 상호 작용 측면에서 보다 유용한 형태의 인공 조직이 만들어지고 세포 분화를 위한 더 나은 틈새 시장을 제공합니다. 또한 자연 미세 환경을 모방하여 세포 메커니즘을 조사하는 데 적합합니다. 또한 스페로이드와 바이오잉크의 낮은 접착력은 바이오잉크에서 쉽게 분리할 수 있게 해주고 응용 분야를 다양하게 사용할 수 있게 해줍니다.
사용된 N-카데린( 그림 7에서 녹색으로 표시)은 세포 신호 전달 메커니즘의 일부이며 뉴런32의 발달에 중요한 역할을 합니다. Class III β-튜불린은 인간 게놈에서 뉴런 마커로 알려진 7가지 이소타입 중 하나입니다. 이 연구에 사용된 WJ-MSC가 뉴런과 유사한 구조를 형성하기 시작한다는 것을 보여줍니다. 이러한 맥락에서 3D 시스템은 세포가 생존력을 유지할 수 있는 보다 적절한 미세 환경을 조성할 것입니다.
마지막으로, 세포 분화 시스템의 임상적 적용 가능성과 관련된 비용으로 인해, 신경 공학에서는 향후 스캐폴드, 세포 및 분화 생체 신호(33 )의 제어된 방출을 갖는 시스템을 개발하고 이를 복합 요법으로 임상에 적용하는 것이 매우 중요하다. 따라서 스페로이드 및 바이오프린팅 방법은 그래핀 및 기타 생체 신호가 하이드로겔에 내장되어 제어된 방식으로 방출되는 추가 연구에도 사용될 수 있습니다. 체외 연구는 in vivo로 가는 길에서 중요한 단계입니다. 프로토 타입으로 제공된 재료가 Good Laboratory Practice 표준에 따라 생산되면 클리닉으로 이전하는 데 필요한 멸균 표준을 달성 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다. 이 프로젝트는 3D 바이오프린팅 기술 개발업체인 HD Bioink와 공동으로 수행되었습니다.
Acknowledgments
본 연구에 사용된 그래핀은 커클라렐리대학교 기계공학과에서 개발되었다. Karabeyoğlu 박사가 기증했습니다. 그래핀 독성 시험은 TÜBİTAK 2209-B-산업 지향 학부 논문 지원 프로그램의 범위 내에서 완료된 "그래핀 도핑된 바이오잉크를 사용한 3D 바이오프린터에서 중간엽 줄기 세포의 인쇄 및 분화"(출원번호: 1139B411802273)라는 제목의 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다. 연구의 다른 부분은 Yildiz Technical University Scientific Research Projects(TSA-2021-4713)에서 제공한 연구 기금의 지원을 받았습니다. 타임랩스 이미징 단계에서 사용된 GFP가 있는 중간엽 줄기 세포는 Virostem Biotechnology에서 기증했습니다. 저자는 생산적인 토론을 해준 Darıcı LAB과 YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB 팀에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
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