Periferik Nöromühendislik için Grafen Bazlı 3D Biyohibrid Hidrojel Biyomürekkebin Hazırlanması ve Karakterizasyonu
Summary
Bu yazıda, periferik doku mühendisliğinde kullanılmak üzere grafen içeren biyohibrid hidrojel biyomürekkebin hazırlanması gösterilmektedir. Bu 3D biyohibrid materyal kullanılarak, kök hücrelerin nöral farklılaşma protokolü gerçekleştirilir. Bu, benzer biyomateryallerin kliniğe getirilmesinde önemli bir adım olabilir.
Abstract
Periferik nöropatiler aksonal hasarın bir sonucu olarak ve bazen de demiyelinizan hastalıklara bağlı olarak ortaya çıkabilir. Periferik sinir hasarı acil hastaların %1,5-5’inde görülen ve önemli iş kayıplarına yol açabilen küresel bir sorundur. Günümüzde iskeleler, uygun hücre hatları ve biyosinyallerden oluşan doku mühendisliği temelli yaklaşımlar, üç boyutlu (3D) biyobaskı teknolojilerinin gelişmesiyle daha uygulanabilir hale gelmiştir. Çeşitli hidrojel biyomateryallerinin kök hücreler, eksozomlar veya biyo-sinyal molekülleri ile kombinasyonu, periferik sinir rejenerasyonundaki mevcut sorunların üstesinden gelmek için sıklıkla çalışılmaktadır. Bu doğrultuda periferik nöro-mühendislikte hidrojeller gibi enjekte edilebilir sistemlerin veya çeşitli biyobaskı yöntemleriyle oluşturulan implante edilebilir kanal yapılarının üretimi önem kazanmıştır. Normal şartlar altında, kök hücreler vücudun rejeneratif hücreleridir ve popülasyonlarını korumak için sayıları ve işlevleri zamanla azalmaz; Bunlar uzmanlaşmış hücreler değildir, ancak yaralanmaya yanıt olarak uygun stimülasyon üzerine farklılaşabilirler. Kök hücre sistemi, kök hücre nişi olarak adlandırılan mikro çevresinin etkisi altındadır. Periferik sinir yaralanmalarında, özellikle nevrozezde, bu mikro çevre, kopmuş sinir uçlarını cerrahi olarak birbirine bağladıktan sonra bile tam olarak kurtarılamaz. Kompozit biyomalzemeler ve kombine hücresel tedaviler yaklaşımı, biyobozunurluk, biyouyumluluk ve işlenebilirlik gibi çeşitli özellikler açısından malzemelerin işlevselliğini ve uygulanabilirliğini arttırır. Bu doğrultuda bu çalışma, grafen bazlı biyohibrid hidrojel modellemesinin hazırlanması ve kullanımını göstermeyi ve kök hücrelerin sinir rejenerasyonunda etkili bir çözüm olabilecek sinir hücrelerine farklılaşma etkinliğini incelemeyi amaçlamaktadır.
Introduction
Organizmanın iç yapısını ve çevreyi birbirine bağlayan mekanizma olan sinir sistemi iki kısma ayrılır: merkezi ve periferik sinir sistemleri. Periferik sinir hasarı, acil servise başvuran hastaların %1,5-5’ini oluşturan ve çeşitli travmalara bağlı olarak gelişen, önemli iş kayıplarına yol açan küresel bir sorundur1,2,3.
Günümüzde periferik nöro-mühendisliğe hücresel yaklaşımlar büyük ilgi görmektedir. Bu yaklaşımlarda kullanılan hücreler arasında kök hücreler ilk sırada gelmektedir. Normal şartlar altında, kök hücreler vücudun rejeneratif hücreleridir ve popülasyonlarını korumak için sayıları ve işlevleri zamanla azalmaz; Bu hücreler uzmanlaşmıştır, ancak yaralanmaya yanıt olarak uygun stimülasyon ile farklılaşabilirler 4,5. Kök hücre hipotezine göre, kök hücre sistemi, kök hücre nişi olarak adlandırılan mikro çevresinin etkisi altındadır. Kök hücrelerin korunması ve farklılaşması, hücreler ve iskeleler kullanılarak doku mühendisliği yoluyla yeniden oluşturulabilen mikro çevrelerinin varlığı olmadan imkansızdır6 7. Doku mühendisliği hem mühendislik hem de biyoloji ilkelerini içeren multidisipliner bir alandır. Doku mühendisliği, canlı dokuların yerini alabilecek ve hasarlı dokuların çıkarılması ve fonksiyonel dokuların sağlanması yoluyla bu dokuların yenilenmesinde kullanılabilecek yapay dokuların oluşturulması için araçlar sağlar8. Doku mühendisliğinin üç temel taşından biri olan doku iskeleleri, doğal ve sentetik malzemelerden farklı yöntemler kullanılarak üretilmektedir9. Üç boyutlu (3D) baskı, çeşitli yöntemler kullanarak karmaşık şekillerin basit ama çok yönlü üretimi yoluyla kusurlu dokuları değiştirmek veya restore etmek için yaygın olarak kullanılan, gelişmekte olan bir katmanlı üretim teknolojisidir. Biyobaskı, biyomürekkepler10 olarak adlandırılan hücrelerin ve biyomalzemelerin bir arada bulunmasını sağlayan katkısal bir üretim yöntemidir. Sinir hücrelerinin birbirleriyle etkileşimi göz önüne alındığında, çalışmalar grafen gibi iletken biyomateryal adaylarına kaymıştır. Esnek elektronik, süper kapasitörler, piller, optikler, elektrokimyasal sensörler ve enerji depolama gibi özelliklere sahip olan grafen nanoplakalar, doku mühendisliği alanında tercih edilen bir biyomalzemedir11. Grafen, hasarlı doku ve organların çoğalması ve yenilenmesinin yapıldığı çalışmalarda kullanılmıştır12,13.
Doku mühendisliği üç temel yapı taşından oluşur: iskele, hücreler ve biyosinyal molekülleri. Periferik sinir hasarı ile ilgili çalışmalarda bu üç yapının tam olarak sağlanması açısından eksiklikler bulunmaktadır. Çalışmalarda üretilen ve kullanılan biyomateryallerde sadece kök hücre veya biyosinyal molekülleri içermeleri, kök hücre farklılaşmasını sağlayacak biyoaktif molekülün olmaması, kullanılan biyomateryalin biyouyumluluğunun olmaması, doku nişindeki hücrelerin çoğalması üzerindeki etkisinin düşük olması gibi çeşitli sorunlarla karşılaşıldığı, ve böylece sinir iletiminin tam olarak gerçekleşmemesi 2,13,14,15,16. Bu, sinir rejenerasyonunun optimizasyonunu, kas atrofisinin 17,18’in azaltılmasını ve bu tür sorunlara karşı büyüme faktörleri ile gerekli homing 19’un oluşturulmasını gerektirir. Bu noktada, kliniğe aktarılacak bir cerrahi biyomateryal prototipinin nöroaktivitesinin karakterizasyonu ve analizi çok önemlidir.
Buna göre, bu yöntem çalışması, bir 3D biyoyazıcı tarafından oluşturulan grafen nanoplakaları ile biyomürekkep hidrojel desenlemesini ve içerdiği kök hücrelerin nörojenik farklılaşması üzerindeki etkinliğini araştırmaktadır. Ayrıca, grafenin nörosfer oluşumu ve farklılaşması üzerindeki etkileri araştırılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mühendislik ürünü 3D iskelelerle uygulanan tedavilerin geleneksel 2D yöntemlere göre avantajları her geçen gün daha belirgin hale gelmektedir. Bu tedavilerde tek başına veya biyouyumluluğu düşük, biyolojik olarak parçalanabilirliği düşük çeşitli biyomalzemelerden üretilen iskelelerle birlikte kullanılan kök hücreler periferik sinir rejenerasyonunda genellikle yetersiz kalmaktadır. Wharton’un jöle mezenkimal kök hücreleri (WJ-MSC’ler), özellikle edinim protokollerinin optimizasyonu, çoğalm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada kullanılan grafen, Kırklareli Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü’nde geliştirilmiştir. Dr. Karabeyoğlu tarafından bağışlanmıştır. Grafen toksisite testi, TÜBİTAK 2209-B-Sanayi Odaklı Lisans Tez Destek Programı kapsamında tamamlanan “Grafen Katkılı Biyomürekkepli 3D Biyoyazıcılarda Mezenkimal Kök Hücrelerin Basımı ve Farklılaştırılması” (Uygulama No: 1139B411802273) başlıklı proje ile finanse edilmiştir. Çalışmanın diğer kısmı ise Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TSA-2021-4713) tarafından sağlanan araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Hızlandırılmış görüntüleme aşamasında kullanılan GFP’li mezenkimal kök hücreler Virostem Biyoteknoloji tarafından bağışlandı. Yazarlar, verimli tartışmalar için Darıcı LAB ve YTÜ Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği LAB ekibine teşekkür eder.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. . Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman’s Medical Cell Biology, Fourth Edition. , 361-380 (2021).
- Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
