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Bioengineering

Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Abstract

La microscopie de traction à micromotifs permet de contrôler la forme des cellules individuelles et des amas de cellules. En outre, la capacité de modeler à l’échelle de longueur micrométrique permet l’utilisation de ces zones de contact à motifs pour la mesure des forces de traction, car chaque point micromotif permet la formation d’une seule adhérence focale qui déforme ensuite l’hydrogel sous-jacent mou. Cette approche a été utilisée pour un large éventail de types de cellules, y compris les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les plaquettes et les cellules épithéliales.

Cette revue décrit l’évolution des techniques qui permettent l’impression de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels de polyacrylamide dans un tableau régulier de points de taille et d’espacement prédéfinis. Comme les motifs à l’échelle micrométrique sont difficiles à imprimer directement sur des substrats souples, les motifs sont d’abord générés sur des couvercles en verre rigide qui sont ensuite utilisés pour transférer le motif à l’hydrogel pendant la gélification. Tout d’abord, l’approche originale d’impression par microcontact pour générer des tableaux de petits points sur le couvercle est décrite. Une deuxième étape qui supprime la majeure partie du motif pour laisser des îlots de petits points est nécessaire pour contrôler les formes des cellules et des amas de cellules sur de tels tableaux de points à motifs.

Ensuite, une évolution de cette approche qui permet la génération d’îlots de points à l’aide d’une seule étape de motif soustractif est décrite. Cette approche est grandement simplifiée pour l’utilisateur mais présente l’inconvénient d’une durée de vie réduite pour le moule maître nécessaire à la fabrication des motifs. Enfin, les approches informatiques qui ont été développées pour l’analyse des images de points déplacés et des champs de traction générés par des cellules ultérieures sont décrites, et des versions mises à jour de ces packages d’analyse sont fournies.

Introduction

La plupart des phénotypes cellulaires exercent des forces de traction sur leur environnement. Ces forces de traction sont générées par le cytosquelette contractile d’une cellule, qui est un réseau d’actine et de myosine, et d’autres biopolymères filamenteux et protéines de réticulation 1,2,3,4. Les forces générées à l’intérieur de la cellule peuvent être transmises à l’environnement extracellulaire ou aux cellules adjacentes, principalement via des protéines transmembranaires telles que les intégrines et les cadhérines, respectivement 5,6. La façon dont une cellule se propage ou se contracte - et l’ampleur des forces de traction associées à ces mouvements - est le résultat d’une conversation intime avec son environnement, qui dépend en grande partie du type et de la quantité de protéines présentes dans la matrice extracellulaire (ECM)7,8 et de la rigidité de l’ECM. En effet, la microscopie à force de traction est devenue un outil inestimable pour comprendre la réactivité cellulaire aux stimuli locaux tels que la rigidité du substrat, les contraintes et déformations mécaniques imposées, ou le contact avec d’autres cellules. Cette information est directement pertinente pour la compréhension de maladies telles que le cancer et l’asthme 9,10,11,12.

Un système pouvant être utilisé pour mesurer la déformation induite par la force d’un substrat aux propriétés connues d’un matériau est nécessaire pour calculer les forces de traction. Ces changements doivent être suivis au fil du temps, ce qui nécessite à la fois des techniques d’imagerie et de traitement d’image. L’une des premières méthodes utilisées pour déterminer les forces de traction cellulaire a été l’observation et l’analyse de la contraction des hydrogels de collagène ensemencés avec des cellules, bien que cette méthode n’ait été que semi-quantitative13. Une autre méthode, plus raffinée, consistait à mesurer les forces de traction exercées par des cellules individuelles en déterminant les forces résultant de la déformation d’une fine feuille de silicone14. Plus tard, des techniques de mesure plus quantitatives ont été développées, et ces méthodes ont également permis l’utilisation d’hydrogels mous tels que le polyacrylamide (PAA)12,15,16. Lors de l’utilisation de ces matériaux mous, les forces de traction ont pu être déterminées à partir du déplacement induit par la force des billes déplacées aléatoirement incorporées dans l’hydrogel et des propriétés mécaniques du gel16,17. Une autre avancée est venue avec le développement de réseaux de micropostes en polydiméthylsiloxane mou (PDMS) afin que leur déviation puisse être mesurée et convertie en force en utilisant la théorie du faisceau18.

Enfin, des méthodes de micromotifs d’hydrogels mous ont été développées car ces approches permettent de contrôler les zones de contact pour l’adhésion cellulaire. En mesurant la déformation du micromotif dans la zone de contact d’une cellule, les forces de traction pourraient facilement être calculées car une image de référence sans force n’est pas nécessaire19. Cette méthode a été largement adoptée car elle permet la modélisation indirecte d’un réseau régulier de points d’adhésion de protéines fluorescentes discrètes de la taille d’un micron sur des gels PAA pour la mesure des forces de traction cellulaire20. Pour calculer ces forces, un algorithme de traitement d’image, qui permet de suivre les mouvements de chaque point micromotif sans nécessiter l’intervention de l’utilisateur, a été développé21.

Bien que cette méthode soit simple pour créer des grilles entières de motifs de points, elle est plus compliquée lorsque des motifs de taches isolées (ou d’îlots) de points sont souhaités. Les îlots à micromotifs sont utiles lorsque le contrôle de la forme et, dans une certaine mesure, de la taille des amas de cellules est nécessaire. Pour créer ces îlots, la méthode d’impression par microcontact susmentionnée nécessite deux étapes distinctes : i) l’utilisation d’un tampon PDMS pour créer un motif haute fidélité de points sur un couvercle, puis ii) l’utilisation d’un deuxième tampon PDMS différent pour enlever la plupart de ces points, laissant derrière eux des îlots isolés de points21. La difficulté de créer des îlots avec cette méthode originale est aggravée par le fait que la création de modèles de grille cohérents dans la première étape du processus est difficile en soi. Les timbres de micro-impression sont composés d’un ensemble de micro-poteaux circulaires, dont le diamètre correspond à la taille de point souhaitée. Ces tampons sont ensuite recouverts d’une couche uniforme de protéines, puis estampés avec une pression précise sur les couvercles traités pour créer le motif souhaité. D’une part, l’application d’une pression excessive sur le tampon peut entraîner un transfert de protéines inégal et une mauvaise fidélité du motif en raison du flambement des piliers ou de l’affaissement entre les piliers, entraînant un contact avec le verre. D’autre part, l’application de trop peu de pression entraîne peu ou pas de transfert de protéines et une mauvaise fidélité du modèle. Pour ces raisons, un processus de transfert pouvant être utilisé pour créer de manière cohérente des micromotifs de haute qualité d’îlots de points isolés en une seule étape est souhaité.

Ici, une méthode est décrite pour le micromotif indirect d’îlots de points d’adhésion de protéines fluorescentes de taille micronique sur un gel PAA qui est plus cohérent et polyvalent que les méthodes précédemment développées. Alors que les anciennes méthodes de micromodélisme indirect reposent sur le transfert de motifs protéiques d’un tampon PDMS à un substrat intermédiaire, la méthode présentée ici utilise plutôt des tampons PDMS comme récipient pour l’élimination des protéines, et non pour l’addition. Cela se fait d’abord en changeant fondamentalement la structure des timbres PDMS utilisés. Plutôt que de fabriquer des timbres composés d’un motif de piliers circulaires uniformément espacés, les timbres sont constitués d’un motif de trous circulaires uniformément espacés dans cette méthode.

Avec cette nouvelle structure, la surface de ces tampons PDMS peut ensuite être traitée avec du glutaraldéhyde comme décrit précédemment 20,29,30, ce qui rend le tampon capable de se lier de manière covalente avec la protéine. Lorsqu’ils sont utilisés sur un couvercle en verre recouvert uniformément de protéines fluorescentes, ces tampons PDMS traités au glutaraldéhyde sont utilisés pour éliminer la majeure partie de la protéine à la surface du couvercle, ne laissant derrière eux que le motif souhaité de points prédéterminé par l’emplacement des trous de la taille d’un micron sur le tampon. Ce changement augmente le taux de réussite pour générer des modèles constitués d’une grille de points presque continue et pour créer des îlots isolés de points en une seule étape.

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Protocol

1. Création de masters en silicone

REMARQUE: La majeure partie du processus de conception, de création et de dépannage des maîtres de silicium pour le moulage répété des tampons PDMS a été couverte précédemment21, de sorte que seules les principales différences de cette nouvelle approche seront décrites ici.

  1. Créez la conception du photomasque à l’aide d’AutoCAD ou d’un logiciel de conception similaire. Enduisez un côté du photomasque, un mince morceau de verre, d’une fine couche de chrome pour contrôler la diffusion de la lumière UV. Concevez le photomasque de manière à ce que la lumière UV brillante à travers lui sur la résine photosensible choisie crée un maître en silicone avec l’inverse des caractéristiques souhaitées sur les timbres PDMS finaux. Reportez-vous à la figure 1 pour la conception de ce masque.
    REMARQUE: La question de savoir si les caractéristiques souhaitées ou la zone à l’extérieur doivent être rendues transparentes sur le photomasque dépend de la résine photosensible choisie. La résine photosensible utilisée ici est SU-8 2005 (ATTENTION: inflammable, irritant pour la peau et les yeux; tenir à l’écart de la chaleur / flammes / étincelles et utiliser des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation), une résine photosensible négative capable de fabriquer des caractéristiques de 5 μm de haut avec des parois latérales presque verticales.
    1. Durcissez la résine photosensible négative en l’exposant à la lumière UV et en éliminant le SU-8 non durci avec un solvant chimique. Par conséquent, concevez les principales caractéristiques du masque pour qu’elles soient transparentes alors que la zone environnante du masque est opaque.
    2. Pour cette nouvelle méthode d’enlèvement, concevez le photomasque de manière à ce qu’il soit composé de deux carrés de 1,5 x 1,5 cm (Figure 1A), l’un plein d’une grille uniforme de 2 cercles μm espacés de 6 μm du centre au centre, et l’autre composé de nombreuses îles carrées qui sont des versions plus petites et isolées de ce même motif de grille (Figure 1B). Créez des îlots des tailles suivantes : 6 x 6 points, 12 x 12 points, 25 x 25 points et 42 x 42 points.
      NOTE: Le diamètre des points d’adhérence (2 μm) a été choisi sur la base d’études antérieures qui ont mesuré les forces de traction cellulaire22,23. Le masque utilisé ici mesure 101,6 x 101,6 mm et est recouvert d’un côté d’une couche de chrome de 0,06 μm d’épaisseur, ce qui est recommandé en raison des petites caractéristiques du maître. Le photomasque utilisé ici a été commandé à une société d’impression de photomasque externe.
  2. Dans une salle blanche, recouvrez uniformément la plaquette de silicium choisie de résine photosensible. En option, traiter la plaquette en surface dans un asher plasma avant de la recouvrir de résistance.
    REMARQUE: Ici, des plaquettes de 100 mm de diamètre sont utilisées. Le traitement dans un asher plasma rend la plaquette plus apte à se lier au SU-8 et aide à prévenir le délaminage du SU-8 de la plaquette.
  3. Effectuez les étapes suivantes conformément aux instructions du fabricant de la résine photosensible :
    1. Faites tourner la plaquette revêtue pour créer l’épaisseur de caractéristique souhaitée, en faisant varier le temps de rotation en fonction de l’épaisseur souhaitée et du type de résistance. Pour un SU-8 2005 de 5 μm d’épaisseur, divisez le programme de spin recommandé en trois étapes :
      1. Enduire la plaquette de résine photosensible en tournant à 500 tr/min pendant 10 s avec une rampe de 100 TR/min.
      2. Réduisez l’épaisseur de la résine à environ 5 μm en faisant tourner la plaquette à 3 000 tr/min avec une rampe de 300 tr/min/s pendant 30 s.
      3. Décélérez lentement la plaquette après la rotation en réduisant la vitesse à 0 RMP avec une rampe de 500 RPM/s pendant 1 s.
    2. Préparez la résine pour l’exposition aux UV en la cuisant brièvement sur une plaque chauffante à 95 °C. Modifier le temps passé sur la plaque chauffante en fonction de l’épaisseur souhaitée de la résine; le temps de cuisson est de 2 min pour un SU-8 2005 de 5 μm d’épaisseur.
    3. Exposez la résistance à la lumière UV pour durcir complètement les caractéristiques souhaitées. Méfiez-vous de la surexposition, car cela peut rendre le SU-8 fragile et affecter la qualité globale du maître résultant.
      1. Utiliser une énergie d’exposition de 105 mJ/cm2 pour un SU-8 2005 de 5 μm d’épaisseur. En fonction de la puissance de la lampe UV disponible, calculez le temps d’exposition en divisant l’énergie d’exposition par la puissance de la lampe en mW.
        REMARQUE: Comme la lampe utilisée ici a une puissance de 8 mW, le temps d’exposition doit être de 13,1 s.
    4. Pour régler les caractéristiques du SU-8 après le développement, cuire à nouveau sur une plaque chauffante à 95 °C, cette fois pendant 3 min. Attendez que les caractéristiques souhaitées du maître apparaissent dans les 1 minute au cours de cette étape de cuisson si la résistance a été exposée correctement.
    5. Retirez le SU-8 non durci de la plaquette de silicium à l’aide du révélateur SU-8. Soyez minutieux lorsque vous retirez le SU-8 non durci, car il peut rester coincé entre les caractéristiques de taille micronique et espacées sur la plaquette.
      ATTENTION: Le révélateur SU-8 est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri de la chaleur, des flammes ou des étincelles et utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez.
    6. Après le développement, rincez avec de l’acétone pour éliminer l’excès de révélateur sur la plaquette et séchez-la complètement avec un pistolet de pulvérisation d’azote.
      ATTENTION : L’acétone est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri des flammes ou des étincelles et utilisez des gants de protection et des lunettes lorsque vous le manipulez.
    7. En option, pour le SU-8 2005, cuire sur une plaque chauffante à 200 °C pendant 10 min.
      REMARQUE: Cette cuisson dure ajoute une résistance mécanique à la résine photosensible.
  4. Après avoir été laissé refroidir, mettez la plaquette dans un plateau de support de plaquette, puis coulez-la dans PDMS. Tout d’abord, effectuez un traitement de silanisation sur la plaquette pour rendre les caractéristiques SU-8 du maître de silicium moins susceptibles de se lier au PDMS et donc moins susceptibles d’être retirées de la surface de la plaquette.
    1. Pour compléter le traitement de surface de silanisation, placez le maître et un petit couvercle en verre à l’intérieur d’un dessiccateur destiné à être utilisé uniquement avec des silanes. Placer 1-2 petites gouttes de Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane sur le couvercle, fermer le dessiccateur et le faire passer sous vide pendant 30 min à une pression de 4 500 Pa24.
      ATTENTION : Le trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri de la chaleur, des flammes ou des étincelles, utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travaillez sous une hotte aspirante.
    2. Éteignez l’aspirateur et laissez le maître et le couvercle dans le dessiccateur pendant encore 30 minutes.
      REMARQUE : Le maître est maintenant prêt pour la coulée dans PDMS.

2. Impression soustractive par microcontact

  1. Mélangez le PDMS dans le bon rapport entre l’agent de durcissement et la base en fonction des instructions du fabricant. Laissez-le reposer à température et pression ambiantes pendant 15 min; puis, dégazez sous vide pendant 15 min.
  2. Versez le PDMS dans le maître et mettez-le dans un incubateur réglé à 37 ° C pendant la nuit pour durcir.
  3. Retirez le maître de l’incubateur et laissez-le refroidir à la température ambiante.
  4. Pendant que le maître refroidit, sonicate 25 mm recouvre l’éthanol pendant 10 min. Utilisez autant de couvertures que le nombre de timbres en cours de préparation.
  5. Rincer soigneusement les couvercles de 25 mm à l’eau désionisée (DI) et sécher à l’aide d’un pistolet à air filtré.
  6. Plasma traiter les couvercles pendant 1 min à l’aide d’un nettoyeur plasma sous vide à haute fréquence (puissance radiofréquence de 30 W). Assurez-vous de libérer l’aspirateur lentement après le traitement pour empêcher les couvercles de se déplacer à l’intérieur de la chambre.
    REMARQUE: Le traitement au plasma de la surface du verre sert à deux fins: il nettoie la surface du verre pour éliminer les contaminants et génère des groupes polaires à base d’oxygène à la surface du verre pour le rendre hydrophobe25. Cette hydrophobicité rend la surface du verre plus propice à la liaison aux protéines.
  7. Dans une pièce dépourvue de lumière directe du soleil et d’éclairage aérien, recouvrir chaque couvercle de 100 μL de solution protéique marquée par fluorescence à une concentration d’au moins 100 μg/mL, couvrir pour une protection supplémentaire contre la lumière et laisser reposer pendant 20 min.
    REMARQUE: Ici, la fibronectine isolée du plasma humain et teinte avec AlexaFluor 488 est utilisée.
    1. Pour teindre la fibronectine, combiner la fibronectine non marquée de concentration et de volume connus avec la quantité appropriée de colorant fluorescent dans un tube de 1,5 mL. Couvrez le tube avec du papier d’aluminium pour protéger le colorant de la lumière et incubez-le à température ambiante pendant 1 h, en mélangeant doucement toutes les 10 minutes en retournant le tube à l’envers 5 à 10 fois.
      REMARQUE: La quantité de colorant requise varie en fonction du colorant utilisé et de la masse de protéines utilisées. Voir le fichier supplémentaire 1 pour la calculatrice utilisée pour déterminer la quantité appropriée de colorant pour la fibronectine étiquetée avec Alexa 488. Selon les instructions du fabricant, l’excès de colorant peut être filtré à l’aide de colonnes de dessalement (voir le tableau des matériaux).
  8. Rincez soigneusement chaque couvercle avec de l’eau DI et retirez l’excès d’eau de la surface en tapotant doucement les côtés de chaque couvercle sur une serviette en papier ou un matériau absorbant similaire. Laissez les couvercles découverts dans l’obscurité pendant au moins 30 minutes pour leur permettre de sécher complètement.
  9. Pendant que les couvercles recouverts de protéines sèchent, retirez le tampon PDMS du maître en le coupant avec un scalpel ou une autre lame tranchante.
    REMARQUE: Il est préférable de ne pas essayer de couper à travers le PDMS à la première tentative, car appliquer autant de pression fissurera la plaquette de silicium et endommagera le maître.
  10. Traitement plasma des tampons PDMS pendant 2 min sous vide à haute fréquence (puissance radiofréquence de 30 W).
  11. Dans une hotte, placez les tampons dans un récipient avec un couvercle et enduisez chaque tampon d’une très fine couche (<100 μL) de 10% (3-aminopropyl)triméthoxysilane (3-APTMS) diluée dans de l’éthanol à 100%.
    ATTENTION: 3-APTMS est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri des flammes ou des étincelles, utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travaillez sous une hotte aspirante. Un revêtement excessif de la solution de 3-APTMS provoquera la formation d’un film orange plus tard dans ce processus. Ce traitement de surface 3-APTMS intègre la fonctionnalité amine dans la surface du tampon PDMS, ce qui permettra une dérivatisation supplémentaire de la surface du timbre plus tard le26.
  12. Couvrez le récipient avec les tampons et laissez-les reposer à température ambiante pendant 5 min.
  13. À l’aide d’eau DI, rincez soigneusement chaque tampon des deux côtés.
  14. Placez les timbres dans un récipient propre et enduisez-les généreusement de 2,5% de glutaraldéhyde dans de l’eau DI.
    ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique; utiliser des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travailler sous une hotte). Ce traitement au glutaraldéhyde, parallèlement au traitement 3-APTMS précédent, fournit des fonctionnalités aldéhydes à la surface des tampons PDMS, qui peuvent réagir avec les groupes amines dans les protéines pour créer une liaison amine secondaire, ce qui est essentiel au processus d’élimination des protéines27.
  15. Couvrez les tampons, laissez-les reposer à température ambiante pendant 30 minutes, puis rincez à nouveau abondamment à l’eau DI. Retirez l’excès d’eau de la surface des timbres de la même manière que les couvercles et laissez les timbres sécher à découvert pendant environ 30 min.
  16. Après 30 min, vérifiez si les couvercles recouverts de protéines et les tampons sont secs. Si l’un ou l’autre n’est pas complètement sec, utilisez un pistolet à air filtré pour les sécher complètement, en veillant à ce que les couvercles ne soient pas exposés à la lumière pendant une période prolongée.
  17. Une fois que les bordereaux de couverture et les tampons sont secs, poussez le motif de tampons vers le bas sur les couvercles avec une pression suffisante pour que les tampons entrent en plein contact avec la surface du couvercle. Laissez les tampons en contact avec les couvercles pendant 15 min.
    REMARQUE: En raison de la liaison amide covalente entre le tampon de glutaraldéhyde et la couche de protéines sur le couvercle en verre - qui est beaucoup plus forte que les faibles interactions hydrophobes entre la couche de protéines et le couvercle en verre - les protéines doivent se décoller du verre selon le motif sur le tampon PDMS une fois qu’il est retiré.
  18. Après 15 minutes, pelez soigneusement les tampons PDMS sur les couvercles.
    REMARQUE: Si le processus de retrait a fonctionné correctement, les tampons ne doivent pas se détacher des couvercles sans résistance, mais ne doivent pas non plus être si fermement collés aux couvercles qu’ils ne peuvent pas être retirés sans force excessive.
  19. Vérifiez la fidélité des couvercles à motifs à l’aide du filtre approprié sur un microscope fluorescent (selon le colorant fluorescent avec lequel les protéines sont marquées).
  20. Utilisez immédiatement les couvercles à motifs ou enregistrez-les et rangez-les à l’abri de la lumière directe.

3. Couvercles activés

REMARQUE: Les couvercles inférieurs destinés à être utilisés dans la chambre expérimentale pour les gels PAA sont fabriqués à cette étape. Ce couvercle inférieur est spécialement traité pour permettre au gel PAA de rester solidement adhéré lorsque le couvercle à motifs supérieurs est retiré pendant le processus de modelage. Des techniques similaires sont également décrites ailleurs 10,12,15,28.

  1. Sonicate 30 mm couvre les couvercles dans de l’éthanol à 100% pendant 10 min, rincer à l’eau DI, puis bien sécher avec un pistolet à air filtré. Préparez jusqu’à 6 couvercles à la fois par lot dans une plaque de 6 puits.
  2. Plasma traiter les couvercles pendant 1 min à haute température (puissance radiofréquence de 30 W) puis placer chaque couvercle dans un puits d’une plaque de 6 puits.
  3. Enduisez chaque couvercle d’une très fine couche d’APTMS à 5% d’éthanol dans une hotte.
    REMARQUE: Un résidu d’orange se formera en cas de revêtement excessif dans ce processus.
  4. Couvrez la plaque à 6 puits et laissez reposer les couvercles pendant 5 min.
  5. Rincez soigneusement les couvercles (des deux côtés) et l’intérieur de chaque puits avec de l’eau DI et éliminez l’excès d’eau à l’intérieur des puits.
  6. Replacez les couvercles dans la plaque à 6 puits et ajoutez environ 2 mL de glutaraldéhyde à 0,5 % dans l’eau DI.
  7. Couvrir la plaque de 6 puits et laisser les couvercles reposer dans la solution de glutaraldéhyde pendant 30 min; ensuite, rincez soigneusement les couvercles et les puits de chaque plaque avec de l’eau DI.
  8. Conservez les couvercles traités dans de l’eau DI dans les plaques de 6 puits jusqu’à deux semaines ou utilisez-les immédiatement. Assurez-vous que les couvercles sont complètement secs avant utilisation.

4. Fabrication de gel PAA et transfert de motifs

REMARQUE: Une fois que les couvertures à motifs sont fabriquées, elles doivent être utilisées pour transférer ces modèles de protéines dans l’hydrogel PAA peu de temps après (<24 h)1,29,30. La recette suivante est pour un gel PAA avec un module de Young de 3,6 kPa. Les quantités de bis-acrylamide, d’acrylamide et d’eau DI peuvent être modifiées pour ajuster la rigidité des gels PAA12.

  1. Juste avant de commencer à fabriquer le précurseur de l’hydrogel PAA, retirez l’ester de l’acide acrylique N-hydroxysuccinimide (NHS) du réfrigérateur afin qu’il puisse atteindre la température ambiante avant d’être ouvert. Préparez un plat à couvercle interchangeable en le stérilisant avec de l’éthanol à 70% et en le laissant reposer sous la lumière UV dans une armoire de biosécurité pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
    ATTENTION: NHS est un irritant toxique pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
    1. Ajouter 1,25 mL d’acrylamide à 40 % dans de l’eau DI dans un tube conique de 15 mL.
      ATTENTION : L’acrylamide est un irritant toxique pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
    2. Ajouter 175 μL de solution de bis-acrylamide dans de l’eau DI dans le même tube (étape 4.1.1).
      ATTENTION : Le bis-acrylamide est un irritant toxique pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
    3. Ajouter 500 μL de 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      ATTENTION : Le PBS est un irritant pour les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation.
    4. Ajouter 2,915 mL d’eau DI.
  2. Pipette 969 μL de ce précurseur dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et conserver le reste à 4 °C pendant deux semaines.
  3. Mesurer environ 50 à 100 mg de persulfate d’ammonium (APS) dans un autre tube de microcentrifugation et le diluer dans de l’eau DI jusqu’à 100 mg / mL; mettez-le de côté pour une utilisation ultérieure. Ouvrez l’ester NHS (maintenant à température ambiante) dans la hotte et mesurez soigneusement jusqu’à 3 mg de NHS dans un tube de microcentrifugation. Diluer l’ester nhs à 1 mg/mL dans 1x PBS.
    ATTENTION: APS est un irritant pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante. L’APS et l’ester de NHS s’hydrolysent au fil du temps, ce qui fait varier l’activité des produits chimiques contenus dans la solution mère. Par conséquent, ces deux solutions doivent être préparées fraîches à chaque fois (contrairement au reste du précurseur).
  4. Effectuez les trois étapes suivantes dans une hotte :
    1. Ajouter 2 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans le tube de microcentrifugation contenant l’aliquote de 969 μL de précurseur de PAA.
      ATTENTION : TEMED est un irritant inflammable pour la peau et les yeux; gardez-le à l’abri de la chaleur, des flammes ou des étincelles, utilisez des gants et des lunettes de protection lors de la manipulation et travaillez sous une hotte aspirante. TEMED est l’un des deux agents de réticulation essentiels à la polymérisation de l’hydrogel PAA, l’autre étant l’APS.
    2. Ajouter 15 μL d’acide chlorhydrique 1 M pour diminuer le pH de la solution d’hydrogel et éviter l’hydrolyse de l’ester NHS.
      ATTENTION : L’acide chlorhydrique est un irritant corrosif pour la peau et les yeux; utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez et travaillez sous une hotte aspirante.
    3. Ajouter 10 μL de la solution d’ester NHS au tube.
      REMARQUE: Le NHS est essentiel au processus de modélisation. Il réagira avec les groupes amines dans les protéines sur le couvercle à motifs pour former une liaison amide stable, ce qui permettra au motif d’être transféré du couvercle en verre à la surface du gel PAA au fur et à mesure qu’il polymérise31.
  5. Effectuez ces dernières étapes dans une armoire de biosécurité :
    1. Placez soigneusement le couvercle de 30 mm dans la partie métallique de l’ensemble de plats à couvercle (3-APTMS et côté traité au glutaraldéhyde vers le haut) et vissez l’anneau en plastique sur le dessus. Configurez le couvercle à motifs de sorte qu’il puisse être facilement atteint à l’étape suivante, tout en le protégeant autant que possible de la lumière.
    2. Pipette 5 μL de solution APS dans le reste du précurseur PAA dans le tube de microcentrifugation, inverser pour mélanger, puis pipeter immédiatement 35 μL de cette solution sur le couvercle de 30 mm.
    3. Déposez la protéine coverslip à motifs sur la solution, en veillant à ne pas créer de bulles d’air dans l’hydrogel. Protégez l’hydrogel de la lumière et laissez-le polymériser pendant 90 min.
    4. Une fois l’hydrogel polymérisé, utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour retirer le couvercle supérieur, en veillant à ce que le couvercle ne glisse pas du gel ou ne retombe pas sur le gel une fois qu’il a été retiré, car cela ruinerait le motif à la surface du gel.
      REMARQUE: Ne laissez pas le gel à découvert dans une zone avec un flux d’air important (comme une armoire de biosécurité).
    5. Pour passiver tout ester DE NHS restant dans l’hydrogel, ajouter 2 mL de PBS stérile au gel et incuber à 37 °C pendant 45 min. Préparez immédiatement les gels pour les expériences ou conservez-les pendant la nuit dans du PBS stérile à 4 °C jusqu’à utilisation.

5. Imagerie

  1. Pour vous préparer à des expériences avec des cellules, allumez la chaleur (37 ° C) et l’humidité (70%) dans le microscope l’après-midi avant une expérience planifiée pour permettre à l’équipement à l’intérieur de la chambre du microscope de s’équilibrer à la température plus élevée.
    REMARQUE: Cette étape minimise la dérive z causée par les fluctuations de température.
  2. Juste avant le début de l’expérience, allumez la source de CO2 de la chambre.
  3. Pour éviter la dérive x-y causée par le mouvement répété de l’étape du microscope pendant l’expérience, fixez l’ensemble de plats à couvercle interchangeable contenant l’hydrogel ensemencé à la scène avec du ruban adhésif double face.
  4. Regardez sur le gel pour trouver des cadres d’intérêt pour l’image, en sauvegardant chaque position d’étape des sections à imager.
  5. Dans la vue en champ clair et la vue fluorescente correspondant à la protéine marquée, réglez le logiciel du microscope pour imager chaque image une fois toutes les 5 minutes pendant 2 h.

6. Analyse d’images

REMARQUE: Un système a été développé qui peut mesurer la déformation des gels PAA à motifs en déterminant l’emplacement des points de traction, en interpolant les emplacements initiaux des points déformés, puis en calculant les forces de traction cellulaire à chaque endroit. Tout système logiciel capable d’effectuer des traitements d’images et des calculs numériques peut être utilisé. Le programme vise à déterminer rapidement les forces de traction, en éliminant les entrées de l’utilisateur et les procédures de prétraitement qui contribueraient aux erreurs liées à l’utilisateur. Le code utilisé ici est disponible ici en tant que fichiers supplémentaires 2-10, et ces fichiers, ainsi qu’une paire d’images de pratique, sont accessibles à www.bu.edu/mml/downloads.

  1. Dans un logiciel de traitement d’image, ouvrez toutes les images individuelles prises au cours d’une expérience timelapse à partir de chaque vue de microscope utilisée dans l’ordre, de la première à la dernière image capturée, et transformez-les en une seule pile d’images (en cliquant sur Image | Piles | Images à empiler). Assurez-vous qu’il existe deux piles d’images distinctes : l’une des vues en fond clair des cellules et l’autre de la vue fluorescente du motif auquel elles sont attachées.
    1. S’il y a une dérive dans les images fluorescentes (c’est-à-dire que l’îlot d’intérêt se déplace dans la direction x et/ou y entre chaque image de >1 à 2 μm), traitez d’abord la pile d’images avec le plugin StackReg (P. Thévenaz, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne) pour recentrer chaque image de la pile en fonction de la position de la première (en cliquant sur Plugins | | StackReg | de traduction D’accord).
      REMARQUE: Ceci est essentiel car même une dérive inférieure à μm peut affecter de manière significative le calcul final des forces de traction, en particulier sur les gels plus rigides où cette dérive x-y est en dehors de la plage de bruit attendue. Ce code enregistrera les images après la suppression de la dérive, qui peuvent ensuite être transformées en une nouvelle pile d’images à analyser.
  2. Entrez les piles d’images en champ clair et fluorescentes dans CTFTimelapse.m (fichier supplémentaire 2).
    1. Spécifiez le répertoire de fichiers où se trouvent les piles d’images à la ligne 7.
    2. Aux lignes 8 et 9, spécifiez les noms de la pile d’images fluorescentes et de la pile fluorescente en champ lumineux correspondante, respectivement.
    3. Spécifiez la rigidité du gel PAA (Pa):
      1. Dans les lignes 11 à 14, qui comprennent quelques différents modules élastiques d’hydrogels PAA utilisés le plus souvent, commentez (tapez % au début de la ligne) tous sauf le module élastique du gel dans les images analysées. Vous pouvez également ajouter le module élastique s’il n’est pas déjà présent et commenter le reste (3658.19 Pa pour les images de test).
    4. Spécifiez le rayon de point (m) sur la ligne 15 (1 × 10-6 m pour les images d’essai).
    5. Spécifiez le diamètre maximal possible des points (μm) sur la ligne 16 (2,5 μm pour les images d’essai).
    6. Spécifiez le rapport de pixels (μm/pixel) :
      1. Dans les lignes 17 à 20, qui comprennent quelques rapports de pixels d’image différents basés sur les configurations d’imagerie utilisées précédemment, commentez (tapez % au début de la ligne) tous sauf le rapport de pixels des images analysées. Vous pouvez également ajouter le rapport de pixels utilisé s’il n’est pas déjà présent et commenter le reste (0,1613 μm/pixel pour les images de test).
    7. Aux lignes 35 et 87, spécifiez le répertoire de fichiers dans lequel se trouvent les fichiers de traitement d’image nécessaires.
      REMARQUE: À partir de la pile d’images fluorescentes, le code détermine l’emplacement de chaque point fluorescent et suit le mouvement de chaque point entre chaque image de la pile20. La position initiale des points imprimés en microcontact est connue car ils ne se déforment pas lorsqu’ils sont correctement transférés à l’hydrogel32.
  3. Attendez que deux figures et une boîte de dialogue apparaissent une fois que le programme a trouvé les points. Utilisez la figure 1 pour vous assurer que le programme a trouvé les bons points et n’a pas trouvé beaucoup de points là où il n’y en avait pas. Utilisez la figure 2 pour choisir la grille rectangulaire qui aide le programme à localiser et à calculer les forces de traction cellulaire.
    REMARQUE: La figure 1 est l’image en fond clair de la cellule avec les points trouvés par le programme (qui seront rouges) superposés dessus (voir la figure 3A). La figure 2 est une image affichant les mêmes points que ceux de la figure 1 , mais sans l’image en fond clair en arrière-plan.
    1. Attendez que la boîte de dialogue vous invite à appuyer sur Entrée après avoir sélectionné un point - dans lequel chaque point est l’un des points rouges trouvés par le programme - et a un grand bouton à l’intérieur intitulé Entrée.
    2. Choisissez quatre points différents dans la figure 2 pour créer une grille rectangulaire autour et inclure la cellule/grappe sur ce motif. Sélectionnez chaque point un par un avec un clic gauche de la souris et confirmez-le en appuyant sur Entrée sur le bouton dans la boîte de dialogue susmentionnée. Comptez le nombre de points entre le premier et le deuxième point ainsi que le premier et le troisième point, car le programme demandera ces valeurs une fois que tous les points à quatre coins auront été sélectionnés. Entrez ces valeurs dans la fenêtre de commande (tapez le nombre de points et cliquez sur le bouton Entrée du clavier lorsque vous y êtes invité).
  4. Une fois la grille rectangulaire choisie, attendez que le script calcule les forces de traction qu’il trouve dans la grille en fonction de l’emplacement des points fluorescents. Notez que le script trouve d’abord le vecteur de déplacement (u) du centre géométrique de chaque point, puis calcule le vecteur de force de traction (F) correspondant en utilisant Eq (1) :
    Equation 1(1)
    Où E est le module de Young du substrat PAA, a est le rayon des marqueurs de points fluorescents, et ν est le rapport de Poisson du substrat PAA32. Eq (1) suppose que le substrat est un demi-espace élastique infini, que des forces de traction sont appliquées au centre de chaque marqueur de points circulaires et que l’espacement entre les marqueurs de points est suffisamment grand pour que leurs déplacements respectifs n’interagissent pas les uns avec les autres23.
    REMARQUE: Dans les expériences décrites ici, des marqueurs de points de rayon a = 1 μm et un espacement centre-centre de 6 μm sont utilisés. Des flèches de force de traction à l’intérieur de la cellule/grappe pointant vers l’intérieur vers le centre de la cellule doivent être présentes, tandis que la zone à l’extérieur de la cellule/grappe ne doit pas avoir de flèches de traction présentes (voir Figure 3C-E). Les flèches de traction pointant vers l’extérieur de l’intérieur de la cellule/grappe ou de nombreuses grandes flèches de traction présentes à l’extérieur de la cellule sont révélatrices d’une grille rectangulaire mal choisie.
  5. Une fois que le champ de traction correct est trouvé, sélectionnez une région d’intérêt (ROI) appropriée entourant la cellule/le cluster, qui inclut toutes les flèches de traction dans la cellule à l’aide du curseur.
    1. Pour dessiner le retour sur investissement, cliquez avec le bouton gauche autant de fois que nécessaire pour dessiner une forme de polygone avec autant de côtés que vous le souhaitez, ajuster la forme ou déplacer le retour sur investissement après qu’il a été dessiné en cliquant avec le bouton gauche sur les coins ou les bords, respectivement. Une fois le retour sur investissement dessiné, double-cliquez avec le bouton gauche de la souris pour passer à l’image suivante dans la pile. Répétez cette opération pour toutes les images de la pile de champs lumineux.
      REMARQUE: Le code enregistrera les données de force de traction et de déplacement pour chaque point temporel dans le même dossier que les piles d’images d’origine, qui peuvent ensuite être analysées plus en détail.

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Representative Results

Des hydrogels PAA avec le module de Young de E = 3,6 kPa et le rapport de Poisson de ν = 0,445 ont été fabriqués pour être utilisés par cette méthode de micromotif soustractif. Les hydrogels ont été conçus pour avoir une épaisseur d’environ 100 μm, ce qui leur permet d’être imagés avec la configuration d’imagerie utilisée ici tout en empêchant les cellules de détecter le couvercle rigide sous le gel, ce qui poserait des problèmes dans les études axées sur la détection de rigidité cellulaire23,33. Des gels de nombreux autres niveaux de rigidité (jusqu’à 30 kPa) ont été fabriqués et imagés avec succès à l’aide de la méthode de micromotifsindirects 34, de sorte que la méthode ne se limite pas à l’utilisation d’hydrogels de 3,6 kPa. Les couvercles sont traités à l’avance avec du glutaraldéhyde pour permettre au gel de rester fixé à la lèvre inférieure lorsque le couvercle supérieur à motifs est retiré (Figure 2C, D).

Pour visualiser et mesurer les forces de traction cellulaire au sein des grappes, les hydrogels de 3,6 kPa ont été indirectement modelés avec de la fibronectine fluorescente (figure 2A-D) pour créer des motifs d’îlots de taille et de forme prédéterminées (figure 2E). D’autres types de protéines peuvent également être modelés sur ceshydrogels mous 21,35,36,37,38. La qualité du motif transféré est directement liée à la fidélité du moule maître à partir duquel le tampon PDMS est coulé. Les moules qui ont subi un délaminage SU-8 verront une détérioration de la qualité des motifs fabriqués à partir de tampons moulés à partir de ces moules délaminés. Par exemple, les moisissures avec su-8 délaminé créent souvent des micromotifs contenant des sections de fibronectine non modelée entre les îles prédéterminées. S’ils sont coulés sur un gel, ces motifs permettent la fixation des cellules au gel dans des zones situées à l’extérieur du micromoulus de l’île. Pour cette raison, l’imagerie des amas de cellules attachés à des modèles d’îlots entièrement ou presque intacts était la priorité.

Les cellules musculaires lisses vasculaires bovines (BVSMC) ont été ensemencées sur ces hydrogels à une densité d’environ 60 à 80 × 103 cellules / gel pour favoriser la formation de grappes et ont pu adhérer pendant 18 à 24 heures avant l’imagerie. Juste avant les expériences, les cellules ont été colorées avec une coloration du noyau de cellules vivantes pour permettre aux cellules vivantes d’être identifiées et de déterminer le nombre de cellules dans chaque groupe. Des îlots de micromotifs avec et sans cellules ont été imagés et analysés. Les îlots d’imagerie sans cellules permettaient de calculer le bruit présent dans les calculs de force de traction pour les gels de 3,6 kPa. Ces mesures de déplacement faussement positif peuvent ensuite être utilisées pour déterminer une valeur seuil appropriée en dessous de laquelle les déplacements doivent être exclus.

Il a été constaté que 0,3 μm est généralement suffisant pour éliminer l’infidélité de modèle qui conduit à des mesures de déplacement faussement positives. Cela peut entraîner la perte de tractions à faible force, mais est essentiel pour éliminer les tractions faussement positives. Lors de l’imagerie, les grappes de cellules sur des modèles d’îles pour la plupart intacts ont été priorisées (c.-à-d. celles qui ne manquaient pas beaucoup de points, voire aucun) et la plupart des modèles intacts sans cellules. Chaque ROI a été imagé une fois toutes les 5 minutes pendant 2 h. Le microscope utilisé pour capturer des images des deux cellules et des gels PAA à motifs lors d’expériences prolongées de timelapse était un microscope à fluorescence avec un étage automatique, une source de lumière de fluorescence, une caméra et un logiciel de microscope standard. Ce microscope dispose d’un ensemble personnalisé de filtres pour observer de nombreuses couleurs différentes de fluorescence. L’objectif utilisé pour visualiser les cellules et l’hydrogel à motifs est un objectif d’immersion dans l’eau 40x, NA = 1,15. Ce microscope est également équipé d’un système personnalisé de régulation de la température (37 °C), de l’humidité (70 %) et du CO2 (5 %) pour maintenir la viabilité des cellules pendant de longues expériences.

Pour calculer les forces de traction à partir des images des îlots de micromoptères, un logiciel d’analyse d’images a été utilisé pour suivre les déplacements des points fluorescents de fibronectine au fil du temps. Connaissant les déplacements des points fluorescents et la rigidité du gel PAA sur lequel les points sont modelés, le programme peut déterminer les valeurs des forces de traction transmises par les cellules individuelles et les grappes sur le substrat PAA. Cependant, il existe deux façons dont le programme devient incapable de déterminer les valeurs de traction. Si trop de points dans un cadre d’intérêt donné sont déformés, le programme a du mal à calculer les forces, car le programme s’appuie sur la plupart des points d’une image analysée pour être non déformés. De plus, si deux points sont trop proches l’un de l’autre (distance centre-centre de ≤2 μm20), les déplacements des points individuels pourraient interférer l’un avec l’autre, ce qui empêche la détermination précise de leurs valeurs de déplacement réelles et donc de leurs valeurs de traction. Tant que les micromotifs sont conçus avec des points bien espacés, les cellules ne devraient pas être en mesure de déplacer les points au point de devenir si proches les uns des autres, même sur des substrats plus mous.

La figure 3 montre les fonctionnalités de la méthode de motif de suppression. Ici, la capacité de cette méthode à fabriquer des motifs d’îlot isolés et bien définis de forme prédéterminée est montrée à la figure 3B-E, où les points d’adhésion de la fibronectine ne sont présents que dans la zone souhaitée de l’île. Ces îlots isolés de points d’adhérence permettent en outre un meilleur contrôle de la forme de l’amas, comme le montre la figure 3A. Étant donné que la forme et la taille des îles sont cohérentes, les amas de cellules qui s’y attachent et se développent auront également tendance à avoir une forme cohérente, car les modèles d’îles limitent la zone de croissance des grappes. Enfin, la figure 3B-E montre également la capacité de ces îlots à être utilisés pour calculer les forces de traction cellulaires et la tendance de ces forces de traction à changer au fil du temps. Ici, les forces de traction de l’amas sont les plus importantes autour des bords de l’île. Cela est attendu parce que les cellules aux bords d’un cluster ont moins d’interactions avec les autres cellules du cluster que celles à l’intérieur du cluster. Ainsi, ces cellules sur les bords exercent des forces plus importantes sur le substrat en réponse à la contraction du cytosquelette que les cellules à l’intérieur.

Figure 1
Figure 1 : Conception du photomasque. (A) Représentation de la première moitié du dessin du photomasque utilisé ici, une grille discrète de points de 2 μm de diamètre espacés de 6 μm de centre en centre. Alors que l’image montrée ici n’est qu’une petite partie de la conception, cette grille remplit un espace de 1,5 x 1,5 cm au total sur le photomasque. B) Une représentation de la seconde moitié de la conception du photomasque; voici six petites îles de 6 x 6 points. Sur le photomasque, il y a plusieurs tailles d’île différentes: 6 x 6 (illustré ici), 12 x 12, 25 x 25 et 42 x 42 points. Un tableau également espacé (50 μm entre les îles) de chaque taille d’île occupe un espace de 1,5 x 0,375 cm, et les réseaux de différentes îles sont séparés par 50 μm. Les points de chaque île ont un diamètre de 2 μm et sont espacés de 6 μm d’un centre à l’autre. Les deux sections du masque décrites dans A et B sont séparées par 0,75 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Impression par microcontact soustractif. (A) Un tampon PDMS est traité avec du glutaraldéhyde et mis en contact avec un couvercle en verre recouvert uniformément d’une solution fluorescente de fibronectine. (B) Lors du retrait de la fiche de couverture, le tampon PDMS enlève la majeure partie de la fibronectine fluorescente à la surface de la lèvre de couverture, ne laissant des points de protéine de la taille d’un micron que dans des endroits prédéterminés par la conception du tampon PDMS. (C) Le couvercle à motifs est mis en contact avec un prépolymère PAA et une solution de NHS. (D) Une fois que le gel PAA a été autorisé à polymériser complètement, le couvercle supérieur est retiré et un motif de fibronectine est imprimé sur la surface du gel PAA. (E) Exemple d’îlot discret composé de points uniformément espacés sur un hydrogel PAA avec un module de Young de 3,6 kPa. Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations : PDMS = polydiméthylsiloxane; PAA = polyacrylamide; NHS = N-hydroxysuccinimide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse de cellules sur des micromotifs insulaires. (A) Une image en champ clair d’un groupe de 3 BVSMC superposés sur un micromotif d’îlot de fibronectine fluorescent sur un hydrogel PAA avec un module de Young de 3,6 kPa est montrée. Les points ont un diamètre de 2 μm et sont séparés par 6 μm d’un centre à l’autre. (B) Le motif fluorescent montre qu’un certain nombre de points de fibronectine de l’île ont été déplacés en raison de l’application de forces par les BVSMC. (C) Les forces de traction appliquées sur les points d’adhérence au point de temps 1 (début d’une expérience de 2 h). La direction de ces vecteurs de force est indiquée par la direction des flèches colorées. Leur magnitude est indiquée par la couleur de la flèche et sa valeur correspondante sur la barre de couleur (toutes les valeurs de force sont en nN). La longueur du vecteur est relative en fonction des forces minimales et maximales calculées par le programme pour chaque point temporel. (D) Forces de traction du même amas au point temporel 13 (à mi-chemin d’une expérience de 2 h) (E) Forces de traction du même amas au point temporel 25 (fin d’une expérience de 2 h). Abréviations = BVSMC = cellules musculaires lisses vasculaires bovines; PAA = polyacrylamide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Calculatrice pour l’étiquetage de la fibronectine Il s’agit d’un outil permettant de calculer la quantité correcte de colorant fluorescent Alexa488 à utiliser lors du marquage de la fibronectine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : CTFTimelapse.m Il s’agit du fichier de traitement d’image, qui permet de calculer les forces de traction cellulaires comme décrit dans la section 5 (Analyse d’image). Cela comprend la sélection d’une grille de points souhaitée (étapes 6.3 à 6.3.2) et le choix de la région d’intérêt pour les calculs du FCE (étapes 6.5 et 6.5.1). Tous les fichiers supplémentaires suivants sont appelés directement par ce script ou l’une des autres fonctions utilisées dans celui-ci. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : analyze_initial_image_4 Cette fonction est appelée par CTFTimelapse.m, et son but est de localiser et d’aligner les points fluorescents sur une grille à partir de la première image de la pile d’images du motif de grille déformé pour correspondre au motif de grille non déformé d’origine. Cela permet de calculer la force de traction pour la première image de la pile d’images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4 : analyze_subsequent_images Cette fonction est appelée par CTFTimelapse.m, et son but est de localiser et d’aligner les points fluorescents sur une grille à partir de toutes les images de la pile d’images du motif de grille déformé après le premier. Cela permet de calculer la force de traction pour toutes les images de la pile d’images après la première. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 5 : bpass.m Cette fonction est appelée à la fois par analyze_initial_image_4 et analyser subsequent_images.m, et son but est d’implémenter un filtre passe-bande d’espace réel qui traite la pile d’images du motif de grille déformé. Ce filtre supprime le bruit des pixels et les variations d’image de longue longueur d’onde tout en conservant des informations d’une taille caractéristique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : CellBoundary.m Cette fonction est appelée par CTFTimelapse.m, et son but est qu’elle permet à l’utilisateur du programme de dessiner une région d’intérêt autour de la cellule / cluster pour laquelle les forces de traction doivent être calculées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 7 : pkfnd.m Cette fonction est appelée à la fois par analyze_initial_image_4.m et analyze_subsequent_images.m, et son but est de trouver des maxima locaux dans une image avec une précision au niveau des pixels. Ces pics sont utilisés par cntrd.m pour localiser le motif de grille fluorescente pour CTFTimelapse.m. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 8 : cntrd.m Cette fonction est appelée à la fois par analyze_initial_image_4 et analyze_subsequent_images,m,, et son but est de localiser le centroïde des points lumineux dans une image avec une précision inférieure au pixel. Cela permet de localiser le motif de grille fluorescente par CTFTimelaspe.m, comme décrit à l’étape 6.3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 9 : FourCorners.m Cette fonction est appelée à la fois par analyze_initial_image_4.m et analyze_subsequent_images.m, et son but est de prendre la grille choisie par l’utilisateur (étapes 6.3-6.3.2) et de calculer la distance entre chaque point d’angle en deux axes orthogonaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 10 : track.m Cette fonction est appelée à la fois par analyze_initial_image_4 et analyze_subsequent_images.m, et son but est de suivre le mouvement des points dans le motif de grille fluorescente entre les images, ce qui est essentiel pour calculer les forces de traction correspondantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Une méthode améliorée de modelage indirect des hydrogels PAA est décrite dans cet article. Cette approche s’appuie sur des méthodes qui ont été utilisées précédemment 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Le principal changement est que les tampons PDMS sont maintenant utilisés pour éliminer les protéines et laisser le motif souhaité sur le substrat intermédiaire plutôt que d’estampiller directement le motif dessus. Cela permet la création beaucoup plus cohérente de micromotifs haute fidélité et la création d’îlots de micromotifs isolés qui nécessitaient auparavant deux étapes de production. La forme et la taille des motifs d’île réalisés avec cette méthode sont également plus faciles à contrôler que ceux réalisés avec la méthode précédente en deux étapes. La nouvelle technique est moins sensible à la quantité de pression appliquée pendant la micro-impression que l’ancienne technique. Un deuxième avantage est que cette méthode d’élimination peut créer des motifs d’îlots de forme et de taille contrôlées en une seule étape. En revanche, les méthodes précédentes nécessitaient deux étapes pour fabriquer des îlots, y compris l’estampage pour le dépôt et l’estampage ultérieur pour l’enlèvement, et les formes de ces îlots sont moins précises que celles faites avec la méthode d’enlèvement.

Le principal inconvénient de cette méthode est que la durée de vie des maîtres utilisés pour mouler le nouveau style de timbres PDMS semble être plus courte que celles utilisées dans la méthode d’estampage précédente. Cela peut probablement être attribué à la forme des nouveaux maîtres utilisés dans la méthode d’enlèvement. Les anciens maîtres étaient composés d’une surface de 1,5 x 1,5 cm de SU-8 composée de trous circulaires de 5 μm de profondeur également espacés, qui, lorsqu’ils étaient coulés en PDMS, créaient des timbres constitués de poteaux cylindriques uniformément espacés de la même hauteur. Inversement, les nouveaux masters sont constitués d’une surface de 1,5 x 1,5 cm de poteaux cylindriques SU-8 de 5 μm de haut, qui, lorsqu’ils sont coulés en PDMS, fabriquent des tampons constitués de trous uniformément espacés.

Avec ce changement dans la structure des maîtres, il a été constaté que le SU-8 a tendance à être délaminé de la surface beaucoup plus facilement que dans l’ancienne méthode. Des précautions ont été prises pour éviter cela, telles que le traitement de surface des plaquettes de silicium dans un plasma pour les rendre plus aptes à se lier au SU-8. La surface des plaquettes a également été silanisée avant la première coulée dans le PDMS pour empêcher le SU-8 de coller au PDMS lors du retrait des tampons. Malgré cela, un délaminage SU-8 des plaquettes de silicium a été observé après une coulée répétée dans le PDMS, et des précautions doivent être prises pour s’assurer que de nouvelles plaquettes de silicium sont fabriquées avant la perte du maître actuel. Un moyen possible d’éviter ce délaminage est d’utiliser la méthode PDMS à double coulée, qui a été décrite précédemment43, bien que cette autre méthode ait ses limites.

Un autre défaut de cette méthode (et d’autres méthodes qui utilisent des hydrogels déformables pour mesurer les forces de traction44) est que le champ de traction n’est pas en équilibre mécanique en raison du bruit expérimental. Ainsi, une analyse de post-traitement est nécessaire pour obtenir un champ de traction équilibré après calcul des forces de traction. Une façon d’équilibrer les forces de traction est d’obtenir les forces les plus proches des mesures qui satisfont l’équilibre en utilisant une méthode des moindres carrés. En conséquence, l’amplitude et l’orientation des forces de traction mesurées sont modifiées45.

Il y a des limites à cette méthode de calcul des forces de traction cellulaires. Pour déterminer avec précision les forces de traction cellulaire à l’aide de l’Eq. (1) (étape 5.4), le motif doit être conçu de manière à ce que le déplacement d’un point d’adhérence n’affecte pas de manière significative le déplacement de ceux qui lui sont directement adjacents. Théoriquement, le déplacement d’une région d’adhésion circulaire à la surface d’un demi-espace infini dû à une force tangentielle agissant au centre diminue à mesure qu’une distance radiale du centre du cercle augmentede 23. Plus précisément, pour un substrat dont le rapport de Poisson est d’environ 0,445 (comme ceux décrits ici), le déplacement au bord de la région circulaire est d’environ les deux tiers du déplacement au centre de la région. Cependant, les prédictions théoriques ne s’étendent pas au-delà de la région circulaire. Ainsi, on suppose que la tendance décroissante de l’amplitude de déplacement, déterminée théoriquement23, se poursuit au-delà du bord du cercle d’adhésion. Dans la conception de micromotille décrite ici, des points circulaires de 2 μm espacés de 6 μm d’un centre à l’autre sont utilisés. La raison de cet espacement est qu’un déplacement à la distance de 6 μm du centre d’un point est estimé à environ 1/12e du déplacement au centre du point, qui est supposé être assez petit pour affecter les valeurs de déplacement des points adjacents. Cependant, il est possible que les forces de traction exercées par les cellules déplacent les points d’adhérence sur un substrat à tel point que la distance centre-centre entre eux devient inférieure à 2 μm. Dans ce cas, l’hypothèse selon laquelle le déplacement des points d’adhérence adjacents n’interfèrent pas les uns avec les autres ne tient pas, et les forces de traction ne peuvent pas être calculées avec précision avec l’équation donnée à l’étape 6.4 (Eq (1)).

La technique proposée fournit un outil puissant pour mesurer les forces de traction cellulaires. Ces forces donnent un aperçu de l’environnement mécanique des cellules individuelles et des grappes et peuvent aider à comprendre si et comment différents types de cellules maintiennent la stabilité mécanique. Le maintien d’un niveau homéostatique de tension cellulaire est essentiel pour de nombreux processus cellulaires, et la perte de cette homéostasie tensionnelle a été liée à diverses maladies, telles que l’athérosclérose, l’asthme et le cancer 9,10,12. L’homéostasie tendancielle est définie comme la capacité d’une cellule ou d’un groupe de cellules à maintenir un niveau de tension constant, avec une faible variabilité temporelle autour d’un point de consigne46.

Cette méthode de micromodélisme indirect peut être utilisée pour déterminer la capacité de divers types de cellules à maintenir l’homéostasie tendancielle, tant au niveau individuel que multicellulaire. Cela se fait en suivant les changements dans les valeurs du champ de traction cellulaire au fil du temps, puis en quantifiant la fluctuation temporelle du champ de traction à l’aide du coefficient de variation (CV), qui représente le rapport de l’écart-type de l’amplitude du champ de traction à sa valeur moyenne. La somme des magnitudes des forces de traction et de la magnitude du moment contractile (le premier moment des forces de traction) est utilisée comme mesures scalaires de la magnitude du champ de traction46. Si le CV du champ de traction reste proche de zéro tout au long d’une expérience de timelapse, cela montre que la cellule/grappe a maintenu l’homéostasie tendancielle au cours du temps46.

En résumé, cette nouvelle méthode de micromodélisation indirecte des hydrogels mous offre une méthode plus simple et plus efficace de création d’hydrogels à motifs que les méthodes précédentes. Certaines mesures peuvent être prises pour améliorer et développer cette méthode. Principalement, l’amélioration du processus de fabrication des maîtres de silicium d’une manière qui prolonge leur durée de vie éliminerait le principal inconvénient de cette méthode de micromodélisme. En ce qui concerne les moyens de développer cette méthode, l’exploration de différentes formes d’îles au-delà des îles carrées décrites ici améliorerait la polyvalence de cette méthode.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Paul Barbone du Département de génie mécanique de l’Université de Boston pour ses discussions utiles et son aide à l’analyse des données. Cette étude a été soutenue par la subvention CMMI-1910401 de la NSF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

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References

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Bioingénierie numéro 180
Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs
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Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

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