Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Abstract

Mikrodesen traksiyon mikroskobu, tek hücrelerin ve hücre kümelerinin şeklinin kontrol edilmesini sağlar. Ayrıca, mikrometre uzunluk ölçeğinde modelleme yeteneği, çekiş kuvvetlerinin ölçümü için bu desenli temas bölgelerinin kullanılmasına izin verir, çünkü her mikro desenli nokta, daha sonra yumuşak, altta yatan hidrojeli deforme eden tek bir odak yapışmasının oluşumuna izin verir. Bu yaklaşım, endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, trombositler ve epitel hücreleri dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tipleri için kullanılmıştır.

Bu derlemede, hücre dışı matriks proteinlerinin poliakrilamid hidrojeller üzerine önceden belirlenmiş büyüklük ve aralıktaki düzenli bir dizi nokta dizisinde basılmasına izin veren tekniklerin evrimi açıklanmaktadır. Mikrometre ölçekli desenlerin yumuşak yüzeylere doğrudan basılması zor olduğundan, desenler önce sert cam kapaklarda üretilir ve daha sonra jelasyon sırasında deseni hidrojele aktarmak için kullanılır. İlk olarak, kapak kapağı üzerinde küçük noktalardan oluşan diziler oluşturmak için orijinal mikrotemaslı baskı yaklaşımı açıklanmaktadır. Küçük noktalardan oluşan adalar bırakmak için desenin çoğunu kaldıran ikinci bir adım, bu tür desenli nokta dizileri üzerindeki hücrelerin ve hücre kümelerinin şekillerini denetlemek için gereklidir.

Daha sonra, tek bir çıkarma modelleme adımı kullanarak nokta adalarının oluşturulmasına izin veren bu yaklaşımın bir evrimi açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, kullanıcı için büyük ölçüde basitleştirilmiştir, ancak desenleri yapmak için gereken ana kalıp için azalan bir kullanım ömrünün dezavantajına sahiptir. Son olarak, yer değiştirmiş noktaların ve ardından hücre tarafından oluşturulan çekiş alanlarının görüntülerinin analizi için geliştirilen hesaplama yaklaşımları açıklanmış ve bu analiz paketlerinin güncellenmiş versiyonları sunulmuştur.

Introduction

Çoğu hücre fenotipi, çevrelerine çekiş kuvvetleri uygular. Bu çekiş kuvvetleri, bir aktin ve miyozin ağı olan bir hücrenin kontraktil sitoiskeleti ve diğer filamentli biyopolimerler ve çapraz bağlanan proteinler 1,2,3,4 tarafından üretilir. Hücre içinde üretilen kuvvetler, hücre dışı ortama veya bitişik hücrelere, öncelikle integrinler ve kadherinler gibi transmembran proteinleri aracılığıyla, sırasıyla 5,6 yoluyla iletilebilir. Bir hücrenin nasıl yayıldığı veya büzüldüğü - ve bu hareketlerle ilişkili çekiş kuvvetlerinin büyüklükleri - büyük ölçüde hücre dışı matriste (ECM) 7,8 bulunan proteinin türüne ve miktarına ve ECM'nin sertliğine bağlı olan çevresi ile samimi bir konuşmanın sonucudur. Gerçekten de, çekiş kuvveti mikroskobu, substrat sertliği, uygulanan mekanik gerilmeler ve suşlar veya diğer hücrelerle temas gibi yerel uyaranlara hücre tepkisini anlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Bu bilgiler kanser ve astım gibi hastalıkların anlaşılması ile doğrudan ilgilidir 9,10,11,12.

Çekiş kuvvetlerini hesaplamak için bilinen malzeme özelliklerine sahip bir substratın kuvvet kaynaklı deformasyonunu ölçmek için kullanılabilecek bir sistem gereklidir. Bu değişiklikler zaman içinde izlenmeli ve hem görüntüleme hem de görüntü işleme teknikleri gerektirmelidir. Hücresel çekiş kuvvetlerini belirlemek için kullanılan ilk yöntemlerden biri, hücrelerle tohumlanan kollajen hidrojellerinin kasılmasının gözlemlenmesi ve analiziydi, ancak bu yöntem sadece yarı kantitatif13 idi. Bir başka, daha rafine yöntem, ince bir silikon levha14'ün deformasyonundan kaynaklanan kuvvetleri belirleyerek tek hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetlerini ölçmekti. Daha sonra, daha nicel ölçüm teknikleri geliştirildi ve bu yöntemler poliakrilamid (PAA) 12,15,16 gibi yumuşak hidrojellerin kullanılmasına da izin verdi. Bu yumuşak malzemeler kullanılırken, çekiş kuvvetleri, hidrojele gömülü rastgele yer değiştirmiş boncukların kuvvet kaynaklı yer değiştirmesinden ve jel16,17'nin mekanik özelliklerinden belirlenebilir. Başka bir gelişme, yumuşak polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış mikropost dizilerinin geliştirilmesiyle geldi, böylece sapmaları ışın teorisi18 kullanılarak ölçülebilir ve kuvvete dönüştürülebilirdi.

Son olarak, yumuşak hidrojellerin mikrodesenlenmesi için yöntemler geliştirilmiştir, çünkü bu yaklaşımlar hücre yapışması için temas alanlarının kontrolüne izin verir. Bir hücrenin temas alanındaki mikro modelin deformasyonunu ölçerek, çekiş kuvvetleri kolayca hesaplanabilir, çünkü kuvvetsiz bir referans görüntüsü gerekli değildir19. Bu yöntem, hücresel çekiş kuvvetlerinin ölçümü için PAA jelleri üzerine düzenli bir mikron boyutunda, ayrık floresan protein yapışma noktaları dizisinin dolaylı olarak modellenmesine izin verdiği için yaygın olarak benimsenmiştir20. Bu kuvvetleri hesaplamak için, kullanıcı girdisi gerektirmeden her bir mikro desenli noktanın hareketlerini izleyebilen bir görüntü işleme algoritması geliştirilmiştir21.

Bu yöntem, nokta desenlerinin tüm ızgaralarını oluşturmak için basit olsa da, izole edilmiş nokta yamalarının (veya adalarının) desenleri istendiğinde daha karmaşıktır. Mikro desenli adalar, hücre kümelerinin şeklinin ve bir dereceye kadar boyutunun kontrolüne ihtiyaç duyulduğunda kullanışlıdır. Bu adaları oluşturmak için, yukarıda bahsedilen mikrotemaslı baskı yöntemi iki ayrı adım gerektirir: i) bir kapak kapağı üzerinde yüksek doğrulukta bir nokta deseni oluşturmak için bir PDMS damgası kullanmak ve daha sonra ii) bu noktaların çoğunu kaldırmak için ikinci bir farklı PDMS damgası kullanmak, geride izole edilmiş noktaadaları 21. Bu orijinal yöntemle adalar yaratmanın zorluğu, sürecin ilk adımında tutarlı ızgara desenleri yapmanın kendi başına zor olduğu gerçeğiyle birleşmektedir. Mikro baskı pulları, çapı istenen nokta boyutuna karşılık gelen bir dizi dairesel mikro direkten oluşur. Bu pullar daha sonra eşit bir protein tabakası ile kaplanır ve daha sonra istenen deseni oluşturmak için işlenmiş kapak fişleri üzerine kesin bir basınç miktarıyla damgalanır. Bir yandan, damgaya çok fazla baskı uygulamak, sütunlar arasında sütun burkulması veya sarkması nedeniyle düzensiz protein transferine ve zayıf desen doğruluğuna neden olabilir ve bu da camla temasa neden olabilir. Öte yandan, çok az basınç uygulamak, çok az protein transferine veya hiç protein transferine ve zayıf desen doğruluğuna neden olur. Bu nedenlerden dolayı, sadece bir adımda izole edilmiş nokta adalarının yüksek kaliteli mikro desenlerini tutarlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek bir transfer işlemi istenmektedir.

Burada, mikron büyüklüğündeki floresan protein yapışma noktalarının adalarının, daha önce geliştirilen yöntemlerden daha tutarlı ve çok yönlü olan bir PAA jeli üzerine dolaylı olarak mikrodesenlenmesi için bir yöntem tanımlanmıştır. Eski dolaylı mikrodesenleme yöntemleri, protein kalıplarının bir PDMS damgasından bir ara substrata aktarılmasına dayanırken, burada tanıtılan yöntem, PDMS damgalarını protein giderimi için bir kap olarak kullanır, toplama değil. Bu, önce kullanılan PDMS damgalarının yapısını temelden değiştirerek yapılır. Eşit aralıklı dairesel sütunlardan oluşan bir desenden oluşan pullar yapmak yerine, pullar bu yöntemde eşit aralıklı dairesel deliklerden oluşan bir desenden oluşur.

Bu yeni yapı ile, bu PDMS damgalarının yüzeyi daha sonra daha önce tarif edildiği gibi glutaraldehit ile muamele edilebilir 20,29,30, böylece damga protein ile kovalent olarak bağlanabilir. Floresan proteini ile eşit şekilde kaplanmış bir cam kapak kapağında kullanıldığında, bu glutaraldehit ile muamele edilmiş PDMS damgaları, kapak kaymasının yüzeyindeki proteinin çoğunu çıkarmak için kullanılır ve geride sadece damga üzerindeki mikron büyüklüğündeki deliklerin yeri tarafından önceden belirlenmiş istenen nokta desenini bırakır. Bu değişiklik, neredeyse sürekli bir nokta ızgarasından oluşan desenler oluşturmak ve yalnızca bir adımla izole edilmiş nokta adaları oluşturmak için başarı oranını artırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Silikon ustalarının oluşturulması

NOT: PDMS pullarının tekrar tekrar kalıplanması için silikon kalıpların tasarımı, oluşturulması ve sorun giderme sürecinin çoğu daha önce21 kez ele alınmıştır, bu nedenle bu yeni yaklaşımdaki yalnızca önemli farklılıklar burada açıklanacaktır.

  1. AutoCAD veya benzeri bir tasarım yazılımı kullanarak fotoğraf maskesi tasarımını oluşturun. UV ışık saçılımını kontrol etmek için ince bir cam parçası olan fotomaskenin bir tarafını ince bir krom tabakasıyla kaplayın. Fotomaskeyi, seçilen fotodirencin üzerine UV ışığının parlatılması, nihai PDMS damgalarında istenen özelliklerin tersi ile bir silikon master oluşturacak şekilde tasarlayın. Bu maskenin tasarımı için Şekil 1'e bakın.
    NOT: İstenilen özelliklerin mi yoksa bunların dışındaki alanın mı fotomaske üzerinde şeffaf hale getirilmesi gerektiği, seçilen fotorezistansa bağlıdır. Burada kullanılan fotodirenç SU-8 2005'tir (DİKKAT: yanıcı, cilt ve göz tahriş edici; ısıdan / alevlerden / kıvılcımlardan uzak durun ve kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın), dikey yan duvarlara yakın 5 μm yüksekliğinde özellikler yapabilen negatif bir fotodirençtir.
    1. Negatif fotodirenci UV ışığına maruz bırakarak ve kürlenmemiş SU-8'i kimyasal bir çözücü ile çıkararak kürleyin. Bu nedenle, maskenin temel özelliklerini, maskenin çevresi opak iken şeffaf olacak şekilde tasarlayın.
    2. Bu yeni kaldırma yöntemi için, fotomaskeyi 1,5 x 1,5 cm'lik iki kareden oluşacak şekilde tasarlayın (Şekil 1A), biri merkezden merkeze 6 μm aralıklı 2 μm daireden oluşan eşit bir ızgara ile dolu ve diğeri aynı ızgara deseninin daha küçük, izole edilmiş versiyonları olan birçok kare adadan oluşur (Şekil 1B). Şu boyutlarda adalar oluşturun: 6 x 6 nokta, 12 x 12 nokta, 25 x 25 nokta ve 42 x 42 nokta.
      NOT: Yapışma noktalarının çapı (2 μm), hücresel çekiş kuvvetleri 22,23'ü ölçen önceki çalışmalara dayanarak seçilmiştir. Burada kullanılan maske 101.6 x 101.6 mm'dir ve bir tarafta, master'ın küçük özellikleri nedeniyle önerilen 0.06 μm kalınlığında bir krom tabakası ile kaplanmıştır. Burada kullanılan fotomaske, harici bir fotoğraf maskesi baskı şirketinden sipariş edildi.
  2. Temiz bir odada, seçilen silikon gofreti fotodirençle eşit şekilde kaplayın. İsteğe bağlı bir adım olarak, gofreti dirençle kaplamadan önce bir plazma asherinde yüzeysel olarak işlemden geçirin.
    NOT: Burada 100 mm çapında gofretler kullanılmaktadır. Bir plazma asherinde tedavi, gofreti SU-8'e bağlanmaya daha uygun hale getirir ve SU-8'in gofretten delaminasyonunu önlemeye yardımcı olur.
  3. Fotodirenç üreticisinin talimatlarına göre aşağıdaki adımları uygulayın:
    1. İstenilen unsur kalınlığını oluşturmak için kaplanmış gofreti döndürün, sıkma süresini istenen kalınlığa ve direnç tipine göre değiştirin. 5 μm kalınlığında bir SU-8 2005 için, önerilen spin programını aşağıdaki üç adıma bölün:
      1. Gofreti, 100 RPM/sn rampa ile 10 s boyunca 500 RPM'de döndürerek fotodirençle kaplayın.
      2. Gofreti 30 sn'lik bir rampayla 3.000 RPM'de döndürerek direnç kalınlığını kabaca 5 μm'ye düşürün.
      3. 1 s için 500 RPM / s'lik bir rampa ile hızı 0 RMP'ye düşürerek döndükten sonra gofreti yavaşça yavaşlatın.
    2. UV ışınlarına maruz kalmaya karşı direnci 95 °C'lik bir sıcak plakada kısaca pişirerek hazırlayın. Ocakta harcanan zamanı, direncin istenen kalınlığına göre değiştirin; 5 μm kalınlığında SU-8 2005 için pişirme süresi 2 dakikadır.
    3. İstenilen özellikleri tam olarak iyileştirmek için direnci UV ışığına maruz bırakın. Aşırı pozlamaya karşı dikkatli olun, çünkü bu SU-8'i kırılgan hale getirebilir ve ortaya çıkan master'ın genel kalitesini etkileyebilir.
      1. 5 μm kalınlığında SU-8 2005 için 105 mJ/cm2 pozlama enerjisi kullanın. Mevcut UV lambasının gücüne dayanarak, maruz kalma enerjisini lambanın gücüne mW cinsinden bölerek maruz kalma süresini hesaplayın.
        NOT: Burada kullanılan lamba 8 mW güce sahip olduğundan, pozlama süresi 13,1 s olmalıdır.
    4. Geliştirmenin ardından SU-8 özelliklerini ayarlamak için, 95 °C'lik bir sıcak plaka üzerinde bu kez 3 dakika boyunca tekrar pişirin. Direnç düzgün bir şekilde maruz bırakılmışsa, bu pişirme adımı sırasında master'ın istenen özelliklerinin 1 dakika içinde görünmesini bekleyin.
    5. SU-8 geliştiricisini kullanarak kürlenmemiş SU-8'i silikon gofretten çıkarın. Kürlenmemiş SU-8'i çıkarırken dikkatli olun, çünkü gofret üzerindeki mikron boyutundaki ve aralıklı özellikler arasında sıkışabilir.
      DİKKAT: SU-8 geliştiricisi yanıcı bir cilt ve göz tahriş edicidir; ısıdan/alevlerden/kıvılcımlardan uzak tutun ve kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın.
    6. Geliştirmeden sonra, gofret üzerindeki fazla geliştiriciyi gidermek için asetonla durulayın ve bir azot püskürtme tabancasıyla tamamen kurulayın.
      DİKKAT: Aseton yanıcı bir cilt ve göz tahriş edicidir; alevlerden/kıvılcımlardan uzak tutun ve kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın.
    7. İsteğe bağlı olarak, SU-8 2005 için, 200 °C'lik bir sıcak plakada 10 dakika pişirin.
      NOT: Bu sert fırın, fotorezistansa mekanik mukavemet katar.
  4. Soğumaya bırakıldıktan sonra, gofreti bir gofret taşıyıcı tepsisine koyun ve ardından PDMS'ye dökün. İlk olarak, silikon master'ın SU-8 özelliklerinin PDMS'ye bağlanma olasılığını azaltmak ve böylece gofret yüzeyinden çıkarılma olasılığını azaltmak için gofret üzerinde bir silanizasyon işlemini tamamlayın.
    1. Silanizasyon yüzey işlemini tamamlamak için, master'ı ve küçük bir cam kapak kapağını yalnızca silanlar ile kullanılmak üzere tasarlanmış bir kurutucunun içine yerleştirin. Kapak kapağına 1-2 küçük damla Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan yerleştirin, kurutucuyu kapatın ve 4.500 Pa24 basınçta 30 dakika boyunca vakum altında çalıştırın.
      DİKKAT: Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan yanıcı bir cilt ve göz tahriş edicidir; ısıdan/alevlerden/kıvılcımlardan uzak tutun, kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve duman başlığı altında çalışın.
    2. Vakumu kapatın ve master'ı bırakın ve 30 dakika daha kurutucuda kapak kaymasını sağlayın.
      NOT: Master artık PDMS'de döküm için hazırdır.

2. Çıkarma mikrokontakt baskı

  1. PDMS'yi, üreticinin talimatlarına bağlı olarak kürleme maddesinin tabana doğru oranında karıştırın. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ve basınçta bekletin; daha sonra, 15 dakika boyunca vakum altında gazdan arındırın.
  2. PDMS'yi master'a dökün ve kürlemek için gece boyunca 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatöre koyun.
  3. Master'ı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  4. Master soğurken, 25 mm sonikat kapaklar 10 dakika boyunca etanol içinde kayar. Hazırlanmakta olan pul sayısı kadar kapak fişi kullanın.
  5. 25 mm'lik kapakları deiyonize (DI) suyla iyice durulayın ve filtrelenmiş bir hava tabancası kullanarak kurulayın.
  6. Plazma, yüksek vakum altında bir plazma temizleyici kullanarak kapakları 1 dakika boyunca işlemden geçirir (30 W radyo frekansı gücü). Kapak kapaklarının odanın içinde hareket etmesini önlemek için işlemden sonra vakumu yavaşça serbest bıraktığınızdan emin olun.
    NOT: Cam yüzeyin plazma ile işlenmesi iki amaca hizmet eder: kirleticileri gidermek için camın yüzeyini temizler ve hidrofobik25 yapmak için cam yüzeyinde oksijen bazlı polar gruplar oluşturur. Bu hidrofobiklik, camın yüzeyini protein bağlanmasına daha uygun hale getirir.
  7. Doğrudan güneş ışığı/baş üstü aydınlatması olmayan bir odada, her bir örtüyü en az 100 μg/mL konsantrasyonda 100 μL floresan etiketli protein çözeltisi ile kaplayın, ışıktan ekstra koruma için örtün ve 20 dakika bekletin.
    NOT: Burada, insan plazmasından izole edilmiş ve AlexaFluor 488 ile boyanmış fibronektin kullanılır.
    1. Fibronektini boyamak için, bilinen konsantrasyon ve hacimdeki etiketsiz fibronektin'i 1.5 mL'lik bir tüpte uygun miktarda floresan boya ile birleştirin. Boyayı ışıktan korumak için tüpü alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin, tüpü 5-10 kez baş aşağı çevirerek her 10 dakikada bir hafifçe karıştırın.
      NOT: Gerekli boya miktarı, kullanılan boyaya ve kullanılan protein kütlesine bağlı olarak değişir. Alexa 488 ile etiketlenmiş fibronektin için uygun boya miktarını belirlemek üzere kullanılan hesap makinesi için Ek Dosya 1'e bakın. Üreticinin talimatlarına göre, fazla boya tuzdan arındırma kolonları kullanılarak filtrelenebilir ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  8. Her bir kapak kaymasını DI suyuyla iyice durulayın ve her bir kapak kaymasının kenarlarını bir kağıt havluya veya benzer şekilde emici bir malzemeye hafifçe vurarak yüzeydeki fazla suyu temizleyin. Tamamen kurumasını sağlamak için kapakları karanlıkta en az 30 dakika açık bırakın.
  9. Protein kaplı kapaklar kururken, PDMS damgasını bir neşter veya başka bir keskin bıçakla keserek ustadan çıkarın.
    NOT: İlk denemede PDMS'yi kesmeye çalışmamak en iyisidir, çünkü bu kadar basınç uygulamak silikon gofreti çatlatır ve master'a zarar verir.
  10. Plazma, PDMS damgalarını yüksek vakum altında 2 dakika boyunca işlemden geçirir (30 W radyo frekansı gücü).
  11. Bir duman davlumbazının içine, pulları kapaklı bir kaba yerleştirin ve her pulu% 10 (3-aminopropil)trimetoksisilan (3-APTMS)% 100 etanol içinde seyreltilmiş çok ince bir tabaka (<100 μL) ile kaplayın.
    DİKKAT: 3-APTMS yanıcı bir cilt ve göz tahriş edicidir; alevlerden/kıvılcımlardan uzak tutun, kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve bir duman başlığı altında çalışın. 3-APTMS çözeltisinin aşırı kaplanması, bu işlemin ilerleyen aşamalarında turuncu bir filmin oluşmasına neden olacaktır. Bu 3-APTMS yüzey işlemi, amin işlevselliğini PDMS damgasının yüzeyine dahil eder ve bu da damganın yüzeyinin daha sonra26'da daha fazla türetilmesini sağlar.
  12. Kabı pullarla örtün ve 5 dakika oda sıcaklığında oturmalarını bekleyin.
  13. DI suyu kullanarak, her iki taraftaki her damgayı iyice durulayın.
  14. Pulları temiz bir kaba koyun ve DI suyunda% 2.5 glutaraldehit ile serbestçe kaplayın.
    DİKKAT: Glutaraldehit toksiktir; duman başlığı altında çalışırken ve çalışırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın). Önceki 3-APTMS tedavisinin yanı sıra bu glutaraldehit tedavisi, PDMS damgalarının yüzeyinde, protein giderme işlemi27 için kritik olan ikincil bir amin bağlantısı oluşturmak için proteinlerdeki amin gruplarıyla reaksiyona girebilen aldehit işlevleri sağlar.
  15. Pulları örtün, 30 dakika oda sıcaklığında bekletin ve ardından tekrar DI su ile iyice durulayın. Pulların yüzeyindeki fazla suyu, kapak kapaklarıyla aynı şekilde çıkarın ve pulların ~ 30 dakika boyunca ortaya çıkarılmadan kurumasını bekleyin.
  16. 30 dakika sonra, hem protein kaplı kapakların hem de pulların kuru olup olmadığını kontrol edin. Her ikisi de tamamen kuru değilse, tamamen kurutmak için filtrelenmiş bir hava tabancası kullanın ve kapak kaymalarının uzun süre ışığa maruz kalmamasını sağlayın.
  17. Hem kapak fişleri hem de pullar kuruduktan sonra, pulların kapak fişinin yüzeyiyle tam temas etmesi için pul desenini kapak fişlerinin üzerine doğru yeterli basınçla itin. Pulları 15 dakika boyunca kapaklarla temas halinde bırakın.
    NOT: Glutaraldehit damgası ile cam kapak üzerindeki protein tabakası arasındaki kovalent amid bağı nedeniyle - protein tabakası ile cam kapak kayması arasındaki zayıf hidrofobik etkileşimlerden çok daha güçlüdür - proteinler, çıkarıldıktan sonra PDMS damgasındaki desene göre camı soymalıdır.
  18. 15 dakika sonra, PDMS damgalarını kapak fişlerinden dikkatlice soyun.
    NOT: Çıkarma işlemi doğru çalıştıysa, pullar kapak fişlerinden dirençsiz olarak çıkmamalı, aynı zamanda kapak fişlerine aşırı kuvvet olmadan çıkarılamayacak kadar sıkı bir şekilde yapışmamalıdır.
  19. Bir floresan mikroskop üzerindeki uygun filtreyi kullanarak desenli örtülerin doğruluğunu kontrol edin (proteinlerin hangi floresan boya ile işaretlendiğine bağlı olarak).
  20. Desenli kapak fişlerini hemen kullanın veya doğrudan ışıktan uzak tutun.

3. Aktif kapak kapakları

NOT: PAA jelleri için deney odasında kullanılmak üzere alt kapaklar bu adımda yapılmıştır. Bu alt kapak kayması, desenleme işlemi sırasında üst desenli kapak kayması çıkarıldığında PAA jelinin güvenli bir şekilde yapışmasını sağlamak için özel olarak işlenmiştir. Benzer teknikler başka yerlerde de tanımlanmıştır10,12,15,28.

  1. Sonicate 30 mm kapaklar 100 dakika boyunca% 100 etanol içinde kayar, DI su ile durulayın ve daha sonra filtrelenmiş bir hava tabancası ile iyice kurulayın. 6 delikli bir plakada parti başına bir seferde 6 adede kadar kapak kapağı hazırlayın.
  2. Plazma, kapak fişlerini yüksekte 1 dakika boyunca (30 W radyo frekansı gücü) işleyin ve ardından her bir kapak kaymasını 6 kuyucuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin.
  3. Her bir örtüyü, bir duman davlumbazında etanol içinde% 5 APTMS'lik çok ince bir tabaka ile kaplayın.
    NOT: Bu işlemde aşırı kaplama olması durumunda turuncu bir kalıntı oluşacaktır.
  4. 6 delikli plakayı örtün ve kapak kapaklarının 5 dakika oturmasına izin verin.
  5. Kapakları (her iki tarafta) ve her bir kuyucuğun içini DI suyuyla iyice durulayın ve kuyucukların içindeki fazla suyu temizleyin.
  6. Kapakları 6 delikli plakaya geri yerleştirin ve DI suyuna yaklaşık 2 mL% 0.5 glutaraldehit ekleyin.
  7. 6 delikli plakayı örtün ve kapakların 30 dakika boyunca glutaraldehit çözeltisinde oturmasına izin verin; Daha sonra, her plakanın hem kapaklarını hem de kuyucuklarını DI suyuyla iyice durulayın.
  8. İşlem görmüş kapak kapaklarını 6 delikli plakalar içinde iki haftaya kadar DI suyunda saklayın veya hemen kullanın. Kullanmadan önce kapak kapaklarının tamamen kuru olduğundan emin olun.

4. PAA jel imalatı ve desen transferi

NOT: Desenli kapaklar yapıldıktan sonra, bu protein desenlerini kısa bir süre sonra (<24 saat) 1,29,30 PAA hidrojeline aktarmak için kullanılmalıdır. Aşağıdaki tarif, Young modülü 3.6 kPa olan bir PAA jeli içindir. Bis-akrilamid miktarları, akrilamid ve DI suyu, PAA jellerinin sertliğini ayarlamak için değiştirilebilir12.

  1. PAA hidrojel öncüsünü yapmaya başlamadan hemen önce, akrilik asit N-hidroksisüksinamid (NHS)-esteri buzdolabından çıkarın, böylece açılmadan önce oda sıcaklığına ulaşabilir. Değiştirilebilir bir coverslip tabak setini% 70 etanol ile sterilize ederek ve kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininde UV ışığı altında bekleterek hazırlayın.
    DİKKAT: NHS toksik bir cilt ve göz tahriş edicidir; Kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve duman başlığı altında çalışın.
    1. 15 mL'lik konik bir tüpe DI suyunda 1,25 mL% 40 akrilamid ekleyin.
      DİKKAT: Akrilamid toksik bir cilt ve göz tahriş edicidir; Kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve duman başlığı altında çalışın.
    2. Aynı tüpe DI suyunda 175 μL bis-akrilamid çözeltisi ekleyin (adım 4.1.1).
      DİKKAT: Bis-akrilamid toksik bir cilt ve göz tahriş edicidir; Kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve duman başlığı altında çalışın.
    3. 500 μL 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
      DİKKAT: PBS bir göz tahriş edicidir; Kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın.
    4. 2,915 mL DI su ekleyin.
  2. Bu öncülün 969 μL'lik pipeti, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve geri kalanını iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
  3. Başka bir mikrosantrifüj tüpünde ~ 50-100 mg amonyum persülfat (APS) ölçün ve DI suyunda 100 mg / mL'ye kadar seyreltin; daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun. NHS esterini (şimdi oda sıcaklığında) davlumbazda açın ve bir mikrosantrifüj tüpünde 3 mg'a kadar NHS'yi dikkatlice ölçün. NHS-esteri 1x PBS'de 1 mg / mL'ye seyreltin.
    DİKKAT: APS bir cilt ve göz tahriş edicidir; Kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve duman başlığı altında çalışın. Hem APS hem de NHS-ester zamanla hidrolize olacak ve stok çözeltisindeki kimyasalların aktivitesinin değişmesine neden olacaktır. Bu nedenle, bu çözümlerin her ikisi de her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır (öncülün geri kalanından farklı olarak).
  4. Bir duman davlumbazında sonraki üç adımı gerçekleştirin:
    1. PAA öncülünün 969 μL alikotunu içeren mikrosantrifüj tüpüne 2 μL tetrametilenidiamin (TEMED) ekleyin.
      DİKKAT: TEMED yanıcı bir cilt ve göz tahriş edicidir; ısıdan/alevden/kıvılcımlardan uzak tutun, kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve duman başlığı altında çalışın. TEMED, PAA hidrojelinin polimerizasyonu için kritik öneme sahip iki çapraz bağlama ajanından biridir, diğeri APS'dir.
    2. Hidrojel çözeltisinin pH'ını azaltmak ve NHS-esterin hidrolizini önlemek için 15 μL 1 M hidroklorik asit ekleyin.
      DİKKAT: Hidroklorik asit aşındırıcı bir cilt ve göz tahriş edicidir; Kullanırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanın ve duman başlığı altında çalışın.
    3. Tüpe 10 μL NHS-ester çözeltisi ekleyin.
      NOT: NHS, modelleme süreci için kritik öneme sahiptir. Desenli örtü kayması üzerindeki proteinlerdeki amin gruplarıyla reaksiyona girerek stabil bir amid bağı oluşturacak ve bu da desenin polimerize olurken cam örtü kaymasından PAA jelinin yüzeyine aktarılmasını sağlayacaktır31.
  5. Bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki son adımları uygulayın:
    1. 30 mm'lik kapak kaymasını, kapak kayması kabı setinin metal kısmına (3-APTMS ve glutaraldehit ile işlenmiş tarafı yukarı) dikkatlice yerleştirin ve plastik halkayı üstüne vidalayın. Desenli kapak kayışını, bir sonraki adımda kolayca ulaşılabilecek şekilde ayarlayın, yine de mümkün olduğunca ışıktan koruyun.
    2. Mikrosantrifüj tüpündeki PAA öncüsünün geri kalanına 5 μL APS çözeltisi pipetin, karıştırmak için ters çevirin ve ardından hemen bu çözeltinin 35 μL'sini 30 mm'lik kapak kapağına pipetleyin.
    3. Desenli kapak kayma proteinini çözeltinin üzerine yan yana bırakın, hidrojelde hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Hidrojeli ışıktan koruyun ve 90 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin.
    4. Hidrojel polimerize olduktan sonra, üst kapak kaymasını çıkarmak için bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın, böylece kapak kaymasının jelden kaymamasını veya çıkarıldıktan sonra jelin üzerine geri düşmemesini sağlayın, çünkü bu, jelin yüzeyindeki deseni mahvedecektir.
      NOT: Jeli önemli hava akımı olan bir alanda (biyogüvenlik kabini gibi) açıkta bırakmayın.
    5. Hidrojelde kalan NHS-esteri pasifleştirmek için, jele 2 mL steril PBS ekleyin ve 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Jelleri hemen deneyler için hazırlayın veya kullanana kadar 4 ° C'de steril PBS'de gece boyunca saklayın.

5. Görüntüleme

  1. Hücrelerle deneylere hazırlanmak için, mikroskop odasındaki ekipmanın daha yüksek sıcaklığa dengelenmesini sağlamak için planlanan bir deneyden önce öğleden sonra mikroskopta ısıyı (37 ° C) ve nemi (% 70) açın.
    NOT: Bu adım, sıcaklık dalgalanmalarının neden olduğu z-sürüklenmesini en aza indirir.
  2. Deneyin başlamasından hemen önce, odanın CO2 kaynağını açın.
  3. Deney sırasında mikroskop aşamasının tekrarlanan hareketinin neden olduğu x-y sürüklenmesini önlemek için, hücre tohumlu hidrojeli tutan değiştirilebilir kapak kapağı setini çift taraflı bantla sahneye sabitleyin.
  4. Görüntüyle ilgilenilen çerçeveleri bulmak için jelin üzerine bakın ve görüntülenecek bölümlerin her aşama konumunu kaydedin.
  5. Hem parlak alan görünümünde hem de etiketli proteine karşılık gelen floresan görünümde, mikroskop yazılımını her kareyi 2 saat boyunca her 5 dakikada bir görüntüleyecek şekilde ayarlayın.

6. Görüntü analizi

NOT: Çekiş noktalarının yerini belirleyerek, deforme olmuş noktaların başlangıç konumlarını enterpolasyon yaparak ve daha sonra her bir konumdaki hücresel çekiş kuvvetlerini hesaplayarak desenli PAA jellerinin deformasyonunu ölçebilen bir sistem geliştirilmiştir. Görüntü işleme ve sayısal hesaplamalar yapabilen herhangi bir yazılım sistemi kullanılabilir. Program, çekiş kuvvetlerini hızlı bir şekilde belirlemeyi, kullanıcı girişini ve kullanıcıyla ilgili hatalara katkıda bulunacak ön işleme prosedürlerini ortadan kaldırmayı amaçlamaktadır. Burada kullanılan kod burada Ek Dosyalar 2-10 olarak mevcuttur ve bu dosyalara, bir çift alıştırma görüntüsüyle birlikte, www.bu.edu/mml/downloads erişilebilir.

  1. Bir görüntü işleme yazılımında, zaman atlamalı deney sırasında çekilen tüm görüntüleri, yakalanan ilk görüntüden son görüntüye kadar sırayla kullanılan her mikroskop görünümünden açın ve bunları tek bir görüntü yığınına dönüştürün ( Görüntü | Yığınlar | Yığınlanacak Görüntüler). İki ayrı görüntü yığını olduğundan emin olun: biri hücrelerin parlak alan görünümünden biri ve bağlı oldukları desenin floresan görünümünden biri.
    1. Floresan görüntülerde sürüklenme varsa (yani, ilgi adası her kare arasındaki x- ve / veya y yönünde >1-2 μm) hareket ediyorsa, önce görüntü yığınını StackReg eklentisiyle (P. Thévenaz, İsviçre Federal Teknoloji Enstitüsü Lozan) işleyerek yığındaki her görüntüyü birincinin konumuna göre yeniden ortalayın (Eklentiler | StackReg | Çeviri | Tamam).
      NOT: Bu çok önemlidir, çünkü μm'nin altındaki sapma bile, özellikle bu x-y sürüklenmesinin beklenen gürültü aralığının dışında olduğu daha sert jellerde, çekiş kuvvetlerinin nihai hesaplamasını önemli ölçüde etkileyebilir. Bu kod, sapma kaldırıldıktan sonra görüntüleri kaydeder ve daha sonra analiz edilecek yeni bir görüntü yığınına dönüştürülebilir.
  2. Parlak alan ve floresan görüntü yığınlarını CTFTimelapse.m dosyasına girin (Ek Dosya 2).
    1. Görüntü yığınlarının 7. satırda bulunduğu dosya dizinini belirtin.
    2. 8. ve 9. satırlarda, sırasıyla floresan görüntü yığınının adlarını ve karşılık gelen parlak alan floresan yığınını belirtin.
    3. PAA jel sertliğini (Pa) belirtin:
      1. En sık kullanılan PAA hidrojellerinin birkaç farklı elastik modülünü içeren 11-14 satırlarında, analiz edilen görüntülerdeki jelin elastik modülü hariç hepsini (hattın başlangıcındaki % tipi ) yorumlayın. Alternatif olarak, henüz mevcut değilse elastik modülü ekleyin ve geri kalanını açıklayın (test görüntüleri için 3658,19 Pa).
    4. 15. satırda nokta yarıçapını (m) belirtin (test görüntüleri için 1 × 10-6 m).
    5. 16. satırda mümkün olan maksimum nokta çapını (μm) belirtin (test görüntüleri için 2,5 μm).
    6. Piksel oranını belirtin (μm/piksel):
      1. Daha önce kullanılan görüntüleme kurulumlarına dayalı birkaç farklı görüntü pikseli oranı içeren 17-20. satırlarda, analiz edilen görüntülerin piksel oranı hariç tümü için yorum yapın (satırın başında % yazın ). Alternatif olarak, henüz mevcut değilse kullanılan piksel oranını ekleyin ve geri kalanını (test görüntüleri için 0,1613 μm/piksel) yorumlayın.
    7. 35 ve 87. satırlarda, gerekli görüntü işleme dosyalarının bulunduğu dosya dizinini belirtin.
      NOT: Floresan görüntü yığınından, kod her floresan noktanın konumunu belirler ve her noktanın yığın20'deki her görüntü arasındaki hareketini izler. Mikrotemaslı baskılı noktaların başlangıç konumu bilinmektedir, çünkü hidrojel32'ye düzgün bir şekilde aktarıldıklarında deforme olmazlar.
  3. Program noktaları bulduğunda iki şekil ve bir iletişim kutusunun görünmesini bekleyin. Programın doğru noktaları bulduğundan ve hiç olmadığı yerde çok fazla nokta bulamadığından emin olmak için Şekil 1'i kullanın. Programın hücresel çekiş kuvvetlerini bulmasına ve hesaplamasına yardımcı olan dikdörtgen ızgarayı seçmek için Şekil 2'yi kullanın.
    NOT: Şekil 1 , program tarafından bulunan noktaların (kırmızı olacak) üzerine bindirildiği hücrenin parlak alan görüntüsüdür (bkz. Şekil 3A). Şekil 2 , Şekil 1'de gösterilen noktaların aynısını görüntüleyen, ancak arka planda parlak alan görüntüsü olmayan bir görüntüdür.
    1. İletişim kutusunun Noktayı Seçtikten Sonra Enter tuşuna basmasını isteyin - burada her nokta program tarafından bulunan kırmızı noktalardan biridir - ve içinde Enter etiketli büyük bir düğme vardır.
    2. Şekil 2'de dört farklı nokta seçerek bu desenin etrafında dikdörtgen bir ızgara oluşturun ve bu desene hücreyi/kümeyi ekleyin. Farenin sol tıklamasıyla her noktayı tek tek seçin ve yukarıda belirtilen iletişim kutusundaki düğmeye Enter tuşuna basarak onaylayın. Birinci ve ikinci nokta ile birinci ve üçüncü nokta arasında kaç nokta olduğunu sayın, çünkü dört köşeli noktaların tümü seçildikten sonra program bu değerleri isteyecektir. Bu değerleri komut penceresine girin (nokta sayısını yazın ve istendiğinde klavyedeki enter düğmesini tıklatın).
  4. Dikdörtgen ızgara seçildikten sonra, senaryonun floresan noktaların konumlarına göre ızgara içinde bulduğu çekiş kuvvetlerini hesaplamasını bekleyin. Komut dosyasının önce her noktanın geometrik merkezinin yer değiştirme vektörünü (u) bulduğunu ve ardından Eq (1) kullanarak karşılık gelen çekiş kuvveti vektörünü (F) hesapladığını unutmayın:
    Equation 1(1)
    E, PAA substratının Young modülü olduğunda, a, floresan nokta belirteçlerinin yarıçapıdır ve ν, Poisson'un PAA substratı32'nin oranıdır. Eq (1), substratın sonsuz elastik bir yarı boşluk olduğunu, her dairesel nokta işaretleyicisinin merkezine çekiş kuvvetleri uygulandığını ve nokta işaretçileri arasındaki boşluğun, ilgili yer değiştirmelerinin birbirleriyle etkileşime girmemesi için yeterince büyük olduğunu varsayar23.
    NOT: Burada açıklanan deneylerde, yarıçap a = 1 μm ve 6 μm merkezden merkeze aralığın nokta belirteçleri kullanılmıştır. Hücrenin/kümenin içinde hücrenin merkezine doğru içe doğru işaret eden çekiş kuvveti okları bulunmalı, hücrenin/kümenin dışındaki alanda ise çekiş okları bulunmamalıdır (bkz. Şekil 3C-E). Hücrenin/kümenin içinden dışarıya doğru işaret eden çekiş okları veya hücrenin dışında bulunan birçok büyük çekiş oku, kötü seçilmiş dikdörtgen bir ızgaranın göstergesidir.
  5. Doğru çekiş alanı bulunduğunda, imleci kullanarak hücreyi/kümeyi çevreleyen ve hücre içindeki tüm çekiş oklarını içeren uygun bir ilgi alanı (ROI) seçin.
    1. YG'yi çizmek için, istediğiniz kadar kenarlı bir çokgen şekli çizmek, şekli ayarlamak veya sırasıyla köşelere veya kenarlara sol tıklayarak çizildikten sonra YG'yi hareket ettirmek için gerektiği kadar sol tıklatın. Yatırım getirisi çizildikten sonra, yığındaki bir sonraki görüntüye geçmek için çift sol tıklayın. Parlak alan yığınındaki tüm görüntüler için bunu yineleyin.
      NOT: Kod, her zaman noktası için çekiş kuvveti ve yer değiştirme verilerini orijinal görüntü yığınlarıyla aynı klasöre kaydeder ve bu veriler daha sonra daha fazla analiz edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Young modülü E = 3.6 kPa ve Poisson oranı ν = 0.445 olan PAA hidrojelleri bu çıkarma mikrodesenleme yöntemiyle kullanılmak üzere yapılmıştır. Hidrojeller ~ 100 μm kalınlığında yapıldı, bu da burada kullanılan görüntüleme kurulumuyla görüntülenmelerini sağlarken, hücrelerin jelin altındaki sert örtü kaymasını algılamasını önledi, bu da hücresel sertliği23,33 algılamaya odaklanan çalışmalarda sorunlara neden olacaktı. Diğer birçok sertlik seviyesindeki jeller (30 kPa'ya kadar) dolaylı mikrodesenleme yöntemi34 kullanılarak başarıyla yapılmış ve görüntülenmiştir, bu nedenle yöntem sadece 3.6 kPa hidrojellerin kullanımıyla sınırlı değildir. Kapak kaymaları, üst desenli kapak kayması çıkarıldığında jelin alt kapak kaymasına sabit kalmasını sağlamak için önceden glutaraldehit ile muamele edilir (Şekil 2C, D).

Kümeler içindeki hücresel çekiş kuvvetlerini görselleştirmek ve ölçmek için, 3.6 kPa hidrojeller, önceden belirlenmiş boyut ve şekle sahip ada desenleri oluşturmak için dolaylı olarak floresan fibronektin (Şekil 2A-D) ile desenlenmiştir (Şekil 2E). Diğer protein türleri de bu yumuşak hidrojellerüzerine desenlenebilir 21,35,36,37,38. Aktarılan desenin kalitesi, PDMS damgasının döküldüğü ana kalıbın aslına uygunluğu ile doğrudan ilgilidir. SU-8 delaminasyonuna sahip kalıplar, bu delamine kalıplardan dökülen pullardan yapılan desenlerin kalitesinde bir bozulma görecektir. Örneğin, delamine SU-8'li kalıplar genellikle önceden belirlenmiş adalar arasında desensiz fibronektin bölümleri içeren mikro desenler oluşturacaktır. Bir jel üzerine dökülürse, bu desenler ada mikrodeseni dışındaki alanlarda jele hücre bağlanmasına izin verir. Bu nedenle, tamamen veya çoğunlukla bozulmamış ada modellerine bağlı hücre kümelerinin görüntülenmesi öncelikliydi.

Sığır vasküler düz kas hücreleri (BVSMC'ler), küme oluşumunu teşvik etmek için bu hidrojellere yaklaşık 60-80 × 103 hücre / jel yoğunluğunda tohumlandı ve görüntülemeden önce 18-24 saat boyunca yapışmasına izin verildi. Deneylerden hemen önce, canlı hücrelerin tanımlanmasına ve her kümedeki hücre sayısının belirlenmesine izin vermek için hücreler canlı hücre çekirdeği boyası ile boyandı. Hücreli ve hücresiz mikro model adalar görüntülendi ve analiz edildi. Hücresiz görüntüleme adaları, 3.6 kPa jeller için çekiş kuvveti hesaplamalarında mevcut gürültünün hesaplanmasına izin verdi. Bu yanlış pozitif yer değiştirme ölçümleri daha sonra, yer değiştirmelerin hariç tutulması gereken uygun bir eşik değerini belirlemek için kullanılabilir.

0.3 μm'nin, yanlış pozitif yer değiştirme ölçümlerine yol açan desen sadakatsizliğini ortadan kaldırmak için genellikle yeterli olduğu bulunmuştur. Bunu yapmak, düşük kuvvetli çekişlerin kaybına neden olabilir, ancak yanlış pozitif çekişleri kaldırmak için gereklidir. Görüntüleme sırasında, çoğunlukla bozulmamış ada desenlerindeki hücre kümelerine öncelik verildi (yani, herhangi bir nokta varsa çok fazla eksik olmayanlar) ve çoğunlukla hücresiz bozulmamış desenler. Her yatırım getirisi, 2 saat boyunca her 5 dakikada bir görüntülendi. Uzun süreli zaman atlamalı deneyler sırasında hem hücrelerin hem de desenli PAA jellerinin görüntülerini yakalamak için kullanılan mikroskop, otomatik bir aşamaya, bir floresan ışık kaynağına, bir kameraya ve standart mikroskop yazılımına sahip bir floresan mikroskop idi. Bu mikroskop, birçok farklı floresan rengini gözlemlemek için özel bir filtre setine sahiptir. Hücreleri ve desenli hidrojeli görüntülemek için kullanılan amaç, 40x su daldırma hedefidir, NA = 1.15. Bu mikroskop ayrıca, uzun deneyler sırasında hücreleri canlı tutmak için özelleştirilmiş bir sıcaklık (37 ° C), nem (% 70) ve CO2 (% 5) düzenlenmiş bir sistemle donatılmıştır.

Mikrodesen adalarının görüntülerinden çekiş kuvvetlerini hesaplamak için, floresan fibronektin noktalarının zaman içindeki yer değiştirmelerini izlemek için görüntü analiz yazılımı kullanılmıştır. Floresan noktaların yer değiştirmelerini ve noktaların desenlendiği PAA jelinin sertliğini bilen program, PAA substratı üzerindeki hem bireysel hücreler hem de kümeler tarafından verilen çekiş kuvvetlerinin değerlerini belirleyebilir. Bununla birlikte, programın çekiş değerlerini belirleyememesinin iki yolu vardır. Belirli bir ilgi çerçevesi içinde çok fazla nokta deforme olursa, program kuvvetleri hesaplamak için mücadele eder, çünkü program analiz edilen bir görüntüdeki noktaların çoğunun deforme olmamasına dayanır. Ayrıca, iki nokta birbirine çok yakınsa (merkezden merkeze uzaklık ≤2 μm20), tek tek noktaların yer değiştirmeleri birbirine müdahale edebilir, bu da gerçek yer değiştirme değerlerinin ve dolayısıyla çekiş değerlerinin doğru bir şekilde belirlenmesini önler. Mikro desenler birbirinden iyi aralıklı noktalarla tasarlandığı sürece, hücreler noktaları o kadar fazla değiştirememelidir ki, daha yumuşak substratlarda bile birbirine bu kadar yakın hale gelirler.

Şekil 3, kaldırma modelleme yönteminin yeteneklerini gösterir. Burada, bu yöntemin önceden belirlenmiş şekle sahip izole edilmiş, iyi tanımlanmış ada desenlerini üretme yeteneği, fibronektin yapışma noktalarının sadece adanın istenen alanında bulunduğu Şekil 3B-E'de gösterilmiştir. Bu izole yapışma noktaları adaları, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, küme şeklinin daha iyi kontrol edilmesini sağlar. Adaların şekli ve büyüklüğü tutarlı olduğu için, ada desenleri küme büyüme alanını sınırladığından, üzerlerine yapışan ve büyüyen hücre kümeleri de tutarlı bir şekle sahip olma eğiliminde olacaktır. Son olarak, Şekil 3B-E, bu adaların hücresel çekiş kuvvetlerini hesaplamak için kullanılma yeteneğini ve bu çekiş kuvvetlerinin zaman içinde değişme eğilimini de göstermektedir. Burada, kümenin çekiş kuvvetleri adanın kenarlarındaki en büyük kuvvettir. Bunun nedeni, kümenin kenarlarındaki hücrelerin, kümenin içindeki diğer hücrelerle daha az etkileşime sahip olmasıdır. Böylece, kenarlardaki bu hücreler, sitoiskelet kasılmasına yanıt olarak substrat üzerinde, iç kısımdaki hücrelerden daha büyük kuvvetler uygularlar.

Figure 1
Şekil 1: Fotomaske tasarımı . (A) Burada kullanılan fotomaske tasarımının ilk yarısının bir temsili, 6 μm merkezden merkeze aralıklı 2 μm çapında noktalardan oluşan ayrı bir ızgara. Burada gösterilen görüntü tasarımın sadece küçük bir kısmı olsa da, bu ızgara fotomaske üzerinde toplam 1,5 x 1,5 cm'lik bir alanı doldurur. (B) Fotomaske tasarımının ikinci yarısının bir temsili; Burada 6 x 6 noktalı altı küçük ada gösterilmektedir. Fotomaskede birden fazla farklı ada boyutu vardır: 6 x 6 (burada gösterilmiştir), 12 x 12, 25 x 25 ve 42 x 42 nokta. Her ada boyutunun eşit aralıklı (adalar arasında 50 μm) bir dizisi 1,5 x 0,375 cm'lik bir alan kaplar ve farklı adaların dizileri 50 μm ile ayrılır. Her adadaki noktalar 2 μm çapındadır ve merkezden merkeze 6 μm aralıklıdır. Maskenin A ve B'de açıklanan iki bölümü 0,75 cm ile ayrılmıştır .

Figure 2
Şekil 2: Eksiltmeli mikrokontakt baskı. (A) Bir PDMS damgası glutaraldehit ile muamele edilir ve floresan fibronektin çözeltisi ile eşit şekilde kaplanmış bir cam kapak kapağı ile temas ettirilir. (B) Kapak kapağından çıkarıldıktan sonra, PDMS damgası, kapak kapağının yüzeyindeki floresan fibronektinin çoğunu sıyırır ve mikron boyutunda protein noktalarını yalnızca PDMS damgasının tasarımı tarafından önceden belirlenmiş yerlerde bırakır. (C) Desenli kapak kayması, bir PAA prepolimeri ve NHS çözeltisi ile temas halinde yerleştirilir. (D) PAA jelinin tamamen polimerize olmasına izin verildikten sonra, üst kapak kayması çıkarılır ve PAA jel yüzeyine bir fibronektin paterni basılır. (E) Young modülü 3.6 kPa olan bir PAA hidrojeli üzerinde eşit aralıklı noktalardan oluşan ayrı bir ada desenine bir örnek. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: PDMS = polidimetilsiloksan; PAA = poliakrilamid NHS = N-hidroksisüksinimid. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Ada mikrodesenlerindeki hücrelerin analizi. (A) Young modülü 3.6 kPa olan bir PAA hidrojeli üzerindeki floresan fibronektin adası mikrodeseni üzerine bindirilmiş 3 BVSMC'lik bir kümenin parlak alan görüntüsü gösterilmiştir. Noktalar 2 μm çapındadır ve merkezden merkeze 6 μm ile ayrılır. (B) Floresan paterni, BVSMC'ler tarafından kuvvetlerin uygulanması nedeniyle adadaki fibronektin noktalarının bir kısmının yer değiştirdiğini gösterir. (C) 1 zaman noktasında yapışma noktalarına uygulanan çekiş kuvvetleri (2 saatlik bir deneyin başlangıcı). Bu kuvvet vektörlerinin yönü, renkli okların yönü ile gösterilir. Büyüklükleri ok rengi ve renk çubuğundaki karşılık gelen değeri ile gösterilir (tüm kuvvet değerleri nN cinsindendir). Vektör uzunluğu, her zaman noktası için program tarafından hesaplanan minimum ve maksimum kuvvetlere göre görecelidir. (D) 13 numaralı zaman noktasında aynı kümenin çekiş kuvvetleri (2 saatlik bir deneyin yarısı) (E) 25 numaralı zaman noktasında aynı kümenin çekiş kuvvetleri (2 saatlik bir deneyin sonu). Kısaltmalar = BVSMC'ler = sığır vasküler düz kas hücreleri; PAA = poliakrilamid Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Fibronektini etiketlemek için hesap makinesi Bu, fibronektini etiketlerken kullanılacak doğru Alexa488 floresan boya miktarını hesaplamak için kullanılan bir araçtır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: CTFTimelapse.m Bu, Bölüm 5'te (Görüntü Analizi) açıklandığı gibi hücresel çekiş kuvvetlerinin hesaplanmasını sağlayan görüntü işleme dosyasıdır. Bu, istenen bir nokta ızgarasının seçilmesini (Adım 6.3-6.3.2) ve CTF hesaplamaları için ilgilenilen bölgenin seçilmesini (Adım 6.5 ve 6.5.1) içerir. Aşağıdaki ek dosyaların tümü doğrudan bu komut dosyası veya içinde kullanılan diğer işlevlerden biri tarafından çağrılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: analyze_initial_image_4.m Bu işlev CTFTimelapse.m tarafından çağrılır ve amacı, orijinal deforme olmamış ızgara deseniyle eşleşmesi için deforme olmuş ızgara deseninin görüntü yığınının ilk karesinden bir ızgara üzerindeki floresan noktaları bulmak ve hizalamaktır. Bu, görüntü yığınındaki ilk kare için çekiş kuvveti hesaplamalarına olanak tanır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 4: analyze_subsequent_images.m Bu işlev CTFTimelapse.m tarafından çağrılır ve amacı, ilkinden sonra deforme olmuş ızgara deseninin görüntü yığınının tüm çerçevelerinden bir ızgara üzerindeki floresan noktaları bulmak ve hizalamaktır. Bu, ilkinden sonra görüntü yığınındaki tüm kareler için çekiş kuvveti hesaplamalarına izin verir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 5: bpass.m Bu işlev hem analyze_initial_image_4.m hem de analiz subsequent_images tarafından çağrılır ve amacı, deforme olmuş ızgara deseninin görüntü yığınını işleyen gerçek bir bant geçidi filtresi uygulamaktır. Bu filtre, piksel gürültüsünü ve uzun dalga boylu görüntü varyasyonlarını bastırırken karakteristik boyuttaki bilgileri korur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 6: CellBoundary.m Bu işlev CTFTimelapse.m tarafından adlandırılır ve amacı, program kullanıcısının çekiş kuvvetlerinin hesaplanacağı hücrenin/kümenin etrafına bir ilgi alanı çizmesine izin vermesidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 7: pkfnd.m Bu işlev hem analyze_initial_image_4 hem de analyze_subsequent_images tarafından çağrılır ve amacı, piksel düzeyinde doğrulukla bir görüntüde yerel maksimumu bulmaktır. Bu tepe noktaları cntrd.m tarafından CTFTimelapse.m için floresan ızgara desenini bulmak için kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 8: cntrd.m Bu işlev hem analyze_initial_image_4 hem de analyze_subsequent_images tarafından çağrılır ve amacı, bir görüntüdeki parlak noktaların merkezini alt piksel doğruluğuna bulmaktır. Bu, Adım 6.3'te açıklandığı gibi floresan ızgara deseninin CTFTimelaspe.m tarafından konumlandırılmasını sağlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 9: FourCorners.m Bu işlev hem analyze_initial_image_4 hem de analyze_subsequent_images tarafından çağrılır ve amacı, kullanıcı tarafından seçilen ızgarayı (Adım 6.3-6.3.2) almak ve iki ortogonal eksende her köşe noktası arasındaki mesafeyi hesaplamaktır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 10: track.m Bu işlev hem analyze_initial_image_4 hem de analyze_subsequent_images tarafından çağrılır ve amacı, karşılık gelen çekiş kuvvetlerini hesaplamak için gerekli olan çerçeveler arasındaki floresan ızgara desenindeki noktaların hareketini izlemektir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda PAA hidrojellerinin dolaylı olarak modellenmesi için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, daha önce 20,35,36,37,38,39,40,41,42 numaralı yönteme dayanmaktadır. Birincil değişiklik, PDMS damgalarının artık proteini çıkarmak ve istenen deseni doğrudan üzerine damgalamak yerine ara substrat üzerinde geride bırakmak için kullanılmasıdır. Bu, yüksek doğruluklu mikro desenlerin çok daha tutarlı bir şekilde oluşturulmasına ve daha önce iki üretim adımı gerektiren izole mikro desenli adaların oluşturulmasına izin verir. Bu yöntemle yapılan ada desenlerinin şekli ve büyüklüğü de önceki iki aşamalı yöntemle yapılanlara göre daha kolay kontrol edilmektedir. Yeni teknik, mikrobaskı sırasında uygulanan basınç miktarına karşı eski tekniğe göre daha az hassastır. İkinci bir avantaj, bu kaldırma yönteminin sadece bir adımda kontrollü şekil ve büyüklükte ada desenleri oluşturabilmesidir. Buna karşılık, önceki yöntemler, biriktirme için damgalama ve daha sonra kaldırma için damgalama da dahil olmak üzere adalar yapmak için iki adım gerektiriyordu ve bu adaların şekilleri, kaldırma yöntemiyle yapılanlardan daha az kesindi.

Bu yöntemin en büyük dezavantajı, PDMS damgalarının yeni stilini şekillendirmek için kullanılan ustaların ömrünün önceki damgalama yönteminde kullanılanlardan daha kısa görünmesidir. Bu muhtemelen kaldırma yönteminde kullanılan yeni ustaların şekline bağlanabilir. Eski ustalar, PDMS'ye döküldüğünde, aynı yükseklikte eşit aralıklı silindirik direklerden oluşan pullar oluşturacak eşit aralıklı 5 μm derinliğinde dairesel deliklerden oluşan 1.5 x 1.5 cm'lik bir SU-8 alanından oluşuyordu. Tersine, yeni master'lar, PDMS'ye döküldüğünde, eşit aralıklı deliklerden oluşan pullar yapan 5 μm yüksekliğinde SU-8 silindirik direklerin 1,5 x 1,5 cm'lik bir alanından oluşur.

Masterların yapısındaki bu değişiklikle birlikte, SU-8'in yüzeyden eski yönteme göre çok daha kolay bir şekilde delamine olma eğiliminde olduğu bulunmuştur. Bunu önlemek için, silikon gofretlerin SU-8'e bağlanmaya daha uygun hale getirilmesi için bir plazma asherinde yüzeysel işlem yapılması gibi önlemler alınmıştır. Gofretlerin yüzeyi, damgaların çıkarılmasından sonra SU-8'in PDMS'ye yapışmasını önlemek için PDMS'deki ilk dökümden önce de silanize edildi. Buna rağmen, PDMS'de tekrarlanan dökümden sonra silikon gofretlerden SU-8 delaminasyonu gözlenmiştir ve mevcut ana plakanın kaybından önce yeni silikon gofretlerin yapılmasını sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Bu delaminasyondan kaçınmanın olası bir yolu, daha önce43 olarak tanımlanan PDMS çift döküm yöntemini kullanmaktır, ancak bu diğer yöntemin sınırlamaları vardır.

Bu yöntemin (ve çekiş kuvvetlerini ölçmek için deforme olabilen hidrojeller kullanan diğer yöntemlerin44) bir başka eksikliği, çekiş alanının deneysel gürültü nedeniyle mekanik dengede olmamasıdır. Bu nedenle, çekiş kuvvetleri hesaplandıktan sonra dengeli bir çekiş alanı elde etmek için bir işlem sonrası analize ihtiyaç vardır. Çekiş kuvvetlerini dengelemenin bir yolu, en küçük kareler yöntemini kullanarak dengeyi karşılayan ölçümlere en yakın kuvvetleri elde etmektir. Sonuç olarak, ölçülen çekiş kuvvetlerinin büyüklüğü ve yönü değişir45.

Hücresel çekiş kuvvetlerini hesaplamanın bu yönteminde sınırlamalar vardır. Eq (1) (adım 5.4) kullanarak hücresel çekiş kuvvetlerini doğru bir şekilde belirlemek için, desen, bir yapışma noktasının yer değiştirmesi, doğrudan bitişik olanların yer değiştirmesini önemli ölçüde etkilemeyecek şekilde tasarlanmalıdır. Teorik olarak, merkeze etki eden teğetsel bir kuvvet nedeniyle sonsuz bir yarım uzayın yüzeyinde dairesel bir yapışma bölgesinin yer değiştirmesi, dairenin merkezinden radyal bir mesafearttıkça azalır 23. Spesifik olarak, Poisson'un oranı ~ 0.445 olan bir substrat için (burada açıklananlar gibi), dairesel bölgenin kenarındaki yer değiştirme, bölgenin merkezindeki yer değiştirmenin yaklaşık üçte ikisidir. Bununla birlikte, teorik tahminler dairesel bölgenin ötesine geçmez. Bu nedenle, teorik olarak23 olarak belirlenen yer değiştirme büyüklüğündeki azalma eğiliminin, yapışma çemberinin kenarının ötesinde devam ettiği varsayılmaktadır. Burada açıklanan mikro desen tasarımında, merkezden merkeze 6 μm aralıklı 2 μm dairesel nokta kullanılmıştır. Bu aralığın nedeni, bir noktanın merkezinden 6 μm mesafedeki bir yer değiştirmenin, bitişik noktaların yer değiştirme değerlerini etkileyecek kadar küçük olduğu varsayılan noktanın merkezindeki yer değiştirmenin yaklaşık 1 /12'si olduğu tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetlerinin, bir substrat üzerindeki yapışma noktalarını, aralarındaki merkezden merkeze mesafenin 2 μm'den daha az olacağı şekilde yerinden oynatması mümkündür. Bu durumda, birbirine müdahale etmeyen bitişik yapışma noktalarının yer değiştirmesi varsayımı geçerli değildir ve çekiş kuvvetleri adım 6.4'te (Eq (1)) verilen denklemle doğru bir şekilde hesaplanamaz.

Önerilen teknik, hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için güçlü bir araç sağlar. Bu kuvvetler hem bireysel hücrelerin hem de kümelerin mekanik ortamı hakkında fikir verir ve farklı hücre tiplerinin mekanik stabiliteyi koruyup korumadığını ve nasıl koruduğunu anlamaya yardımcı olabilir. Homeostatik hücre gerginliği seviyesinin korunması birçok hücresel süreç için gereklidir ve bu gergin homeostazın kaybı, ateroskleroz, astım ve kanser gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir 9,10,12. Gerilimsel homeostaz, bir hücrenin veya bir hücre kümesinin, bir ayar noktası46 etrafında düşük bir zamansal değişkenlik ile tutarlı bir gerilim seviyesini sürdürme yeteneği olarak tanımlanır.

Bu dolaylı mikrodesenleme yöntemi, çeşitli hücre tiplerinin hem bireysel hem de çok hücreli seviyelerde gergin homeostazı sürdürme yeteneğini belirlemek için kullanılabilir. Bu, zaman içinde hücresel çekiş alanının değerlerindeki değişiklikleri izleyerek ve daha sonra çekiş alanının büyüklüğünün standart sapmasının ortalama değerine oranını temsil eden varyasyon katsayısını (CV) kullanarak çekiş alanının zamansal dalgalanmasını ölçerek yapılır. Çekiş kuvvetlerinin büyüklüklerinin toplamı ve kasılma momentinin büyüklüğü (çekiş kuvvetlerinin ilk anı), çekiş alanının büyüklüğünün skaler ölçümleri olarak kullanılır46. Çekiş alanının CV'si bir zaman atlamalı deney boyunca sıfıra yakın kalırsa, hücrenin / kümenin zaman içinde gergin homeostazı koruduğunu gösterir46.

Özetle, yumuşak hidrojellerin dolaylı mikrodesenlenmesi için bu yeni yöntem, önceki yöntemlerden daha desenli hidrojeller oluşturmak için daha basit ve daha verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntemi geliştirmek ve genişletmek için atılabilecek bazı adımlar vardır. Öncelikle, silikon ustalarının üretim sürecini ömürlerini uzatacak şekilde geliştirmek, bu mikro modelleme yönteminin birincil dezavantajını ortadan kaldıracaktır. Bu yöntemi genişletmenin yollarına gelince, burada açıklanan kare adaların ötesinde farklı ada şekillerini keşfetmek, bu yöntemin çok yönlülüğünü artıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, Boston Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü'nden Dr. Paul Barbone'a yararlı tartışmalar ve veri analizi konusundaki yardımları için teşekkür eder. Bu çalışma NSF hibesi CMMI-1910401 ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

Biyomühendislik Sayı 180
Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter