Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans
Summary
L’infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell’immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.
Abstract
L’immunità ereditaria descrive come alcuni animali possono trasmettere la “memoria” di una precedente infezione alla loro prole. Questo può aumentare la resistenza agli agenti patogeni nella loro progenie e promuovere la sopravvivenza. Mentre l’immunità ereditaria è stata riportata in molti invertebrati, i meccanismi alla base di questo fenomeno epigenetico sono in gran parte sconosciuti. L’infezione di Caenorhabditis elegans da parte del patogeno microsporidico naturale Nematocida parisii provoca la produzione di vermi che sono robustamente resistenti ai microsporidi. Il presente protocollo descrive lo studio dell’immunità intergenerazionale nel modello di infezione da N. parisii –C. elegans semplice e geneticamente trattabile. L’articolo attuale descrive i metodi per infettare C. elegans e generare prole immuno-innescata. Vengono inoltre forniti metodi per valutare la resistenza all’infezione da microsporidi mediante colorazione per microsporidi e visualizzazione dell’infezione al microscopio. In particolare, l’immunità ereditaria previene l’invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi e l’ibridazione fluorescente in situ (FISH) può essere utilizzata per quantificare gli eventi di invasione. La quantità relativa di spore di microsporidi prodotte nella prole immuno-innescata può essere quantificata colorando le spore con un colorante che lega la chitina. Ad oggi, questi metodi hanno fatto luce sulla cinetica e sulla specificità patogena dell’immunità ereditaria, nonché sui meccanismi molecolari alla base. Queste tecniche, insieme agli ampi strumenti disponibili per la ricerca su C. elegans , consentiranno importanti scoperte nel campo dell’immunità ereditaria.
Introduction
L’immunità ereditaria è un fenomeno epigenetico in cui l’esposizione dei genitori agli agenti patogeni può consentire la produzione di prole resistente alle infezioni. Questo tipo di memoria immunitaria è stato dimostrato in molti invertebrati che mancano di sistema immunitario adattativo e possono proteggere dalle malattie virali, batteriche e fungine1. Mentre l’immunità ereditaria ha importanti implicazioni per la comprensione sia della salute che dell’evoluzione, i meccanismi molecolari alla base di questa protezione sono in gran parte sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che molti degli animali in cui è stata descritta l’immunità ereditaria non sono organismi modello stabiliti per la ricerca. Al contrario, gli studi sul nematode trasparente Caenorhabditis elegans beneficiano di un ampio toolkit genetico e biochimico 2,3, un genoma altamente annotato 4,5 e un breve periodo di generazione. In effetti, la ricerca in C. elegans ha permesso progressi fondamentali nei campi dell’epigenetica e dell’immunità innata 6,7, ed è ora un modello consolidato per lo studio della memoria immunitaria 8,9.
I microsporidi sono patogeni fungini che infettano quasi tutti gli animali e causano infezioni letali negli esseri umani immunocompromessi10. L’infezione inizia quando una spora di microsporidi inietta o “accende” il suo contenuto cellulare (sporoplasma) in una cellula ospite utilizzando una struttura chiamata tubo polare. La replicazione intracellulare del parassita provoca la formazione di meronts, che alla fine si differenziano in spore mature che possono uscire dalla cellula11,12. Mentre questi parassiti sono dannosi sia per la salute umana che per la sicurezza alimentare, c’è ancora molto da imparare sulla loro biologia delle infezioni12. Nematocida parisii è un parassita microsporidiano naturale che si replica esclusivamente nelle cellule intestinali dei vermi, con conseguente riduzione della fecondità e, in definitiva, morte. Il modello di infezione da N. parisii –C. elegans è stato utilizzato per mostrare: (1) il ruolo dell’autofagia nella clearance dei patogeni13, (2) come i microsporidi possono uscire dalle cellule infette in modo non litico14, (3) come i patogeni possono diffondersi da cellula a cellula formando sincizia15, (4) le proteine che N. parisii usa per interfacciarsi con il suo ospite16 e (5) la regolazione della risposta patogena intracellulare trascrizionale (IPR)17, 18.
I protocolli per l’infezione di C. elegans sono descritti nel lavoro attuale e possono essere utilizzati per rivelare la biologia unica dei microsporidi e sezionare la risposta dell’ospite all’infezione. La microscopia di vermi fissi colorati con il colorante legante la chitina Direct Yellow 96 (DY96) mostra la diffusione dell’infezione delle spore di microsporidi contenenti chitina in tutto l’intestino. La colorazione DY96 consente anche la visualizzazione di embrioni di vermi contenenti chitina per la valutazione simultanea della gravidità dei vermi (capacità di produrre embrioni) come lettura dell’idoneità dell’ospite.
Lavori recenti hanno rivelato che C. elegans infettato da N. parisii produce prole che è robustamente resistente alla stessa infezione19. Questa immunità ereditaria dura una sola generazione ed è dose-dipendente, poiché la prole di genitori più pesantemente infetti è più resistente ai microsporidi. È interessante notare che la prole innescata da N. parisii è anche più resistente al patogeno batterico intestinale Pseudomonas aeruginosa, sebbene non sia protetta contro il patogeno naturale Orsay virus19. Il presente lavoro mostra anche che la prole immuno-innescata limita l’invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi. Il metodo descrive anche la raccolta di prole immuno-innescata e come fish può essere utilizzato per rilevare n. parisii RNA nelle cellule intestinali per testare l’invasione delle cellule ospiti e il fuoco delle spore20.
Insieme, questi protocolli forniscono una solida base per lo studio dei microsporidi e dell’immunità ereditaria in C. elegans. Si spera che il lavoro futuro in questo sistema modello consentirà importanti scoperte nel nascente campo dell’immunità ereditaria. Queste tecniche sono anche probabilmente punti di partenza per studiare l’immunità ereditaria indotta da microsporidi in altri organismi ospiti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive lo studio dei microsporidi e dell’immunità ereditaria in un modello di infezione da N. parisii –C. elegans semplice e geneticamente trattabile.
La preparazione delle spore è un protocollo intensivo che in genere produce abbastanza spore per 6 mesi di esperimenti, a seconda della produttività24. È importante sottolineare che l’infettività deve essere determinata per ogni nuovo “lotto” di spore prima di utilizzarlo pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Winnie Zhao e Yin Chen Wan per aver fornito utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
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