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Biology

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Abstract

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) réside à l’arrière de l’œil et remplit des fonctions essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité des tissus rétiniens et vasculaires adjacents. À l’heure actuelle, la capacité réparatrice limitée de l’EPR des mammifères, qui se limite aux petites blessures, a entravé les progrès dans la compréhension des processus de régénération de l’EPR in vivo . Ici, une méthodologie détaillée est fournie pour faciliter l’étude de la réparation in vivo de l’EPR à l’aide du poisson-zèbre, un modèle de vertébré capable d’une régénération tissulaire robuste. Ce protocole décrit un paradigme de lésion transgénique médié par la nitroréductase / métronidazole (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP), qui entraîne l’ablation des deux tiers centraux de l’EPR après un traitement de 24 heures par MTZ, avec récupération tissulaire ultérieure. L’accent est mis sur les ablations de l’EPR chez les larves de poisson-zèbre et les méthodes de test des effets des composés pharmacologiques sur la régénération de l’EPR sont également décrites. La génération et la validation de RpEGEN, un script MATLAB créé pour automatiser la quantification de la régénération RPE basée sur la pigmentation, sont également abordées. Au-delà des mécanismes actifs de réparation de l’EPR, ce protocole peut être étendu aux études de la dégénérescence de l’EPR et des réponses aux blessures, ainsi que des effets des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents, entre autres processus cellulaires et moléculaires. Ce système de poisson-zèbre est très prometteur dans l’identification des gènes, des réseaux et des processus qui stimulent la régénération de l’EPR et les mécanismes liés à la maladie de l’EPR, dans le but à long terme d’appliquer ces connaissances aux systèmes mammifères et, en fin de compte, au développement thérapeutique.

Introduction

La méthodologie décrite ici détaille un protocole pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide de larves de poisson-zèbre. L’EPR s’étend sur l’arrière de l’œil et réside entre les couches stratifiées de la rétine neurale et la couche de vascularisation constituant la choroïde. Le soutien trophique, l’absorption de la lumière phototoxique et le maintien des protéines du cycle visuel ne sont que quelques-unes des fonctions critiques de l’EPR qui sont essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité de ces tissus adjacents1. Les dommages causés à l’EPR chez les mammifères sont réparables lorsque les lésions sont petites2; cependant, les dommages subis par des blessures plus importantes ou une maladie dégénérative progressive sont irréversibles. Chez l’homme, les maladies dégénératives de l’EPR (p. ex., la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la maladie de Stargardt) entraînent une perte de vision permanente et, avec peu d’options de traitement disponibles, une diminution de la qualité de vie des patients. La capacité limitée des RPE des mammifères à s’auto-réparer a créé un manque de connaissances dans le domaine des processus de régénération des EPR. Compte tenu de la capacité de régénération robuste du poisson-zèbre dans de nombreux types de tissus différents, ce protocole a été développé pour établir un système de vertébrés in vivo afin de faciliter les études sur l’EPR à régénération intrinsèque et de découvrir les mécanismes qui déterminent cette réponse. En utilisant le paradigme d’ablation décrit ici, la voie de signalisation canonique Wnt3, la voie mTOR4 et les réponses immunitaires5 ont été identifiées comme des médiateurs critiques de la régénération de l’EPR, probablement avec des fonctions qui se chevauchent.

Dans ce paradigme d’ablation génétique, le poisson-zèbre Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 exprime le gène6 de la nitroréductase dérivée de bactéries (NTR/nfsB) fusionné à l’eGFP sous le contrôle de l’élément amplificateur RPE, rpe65a7. L’ablation est obtenue en ajoutant le promédicament, le métronidazole (MTZ), à l’eau du système abritant le poisson-zèbre. L’activation intracellulaire de MTZ par la nitroréductase entraîne la réticulation de l’ADN et l’apoptose dans les cellules exprimant NTR/nfsB 8,9. Cette technologie a été largement utilisée chez le poisson-zèbre pour ablation des cellules de la rétine 10,11,12,13 et d’autres tissus 8. Ensemble, ces éléments permettent l’expression ciblée (rpe65a) d’une méthodologie d’ablation cellulaire inductible (NTR/MTZ)8,9 et d’un marqueur fluorescent (eGFP) pour la visualisation.

Il existe également d’autres modèles in vivo intéressants qui peuvent être utilisés pour étudier le potentiel de régénération de l’EPR14. Ceux-ci sont larges et comprennent la transdifférenciation de l’EPR à la rétine après la rétinbectomie chez les amphibiens, dans laquelle les cellules d’EPR perdues par la repousse rétinienne sont remplacées15,16; Restauration de l’EPR après une blessure chez la souris LMR/MpJ « super cicatrisante »17; et stimulation exogène de la prolifération de l’EPR chez un modèle de rat d’EPR spontanée et de dégénérescence rétinienne18, entre autres. Des modèles in vitro, tels que les cellules souches EPR humaines adultes (CSP)19 ont également été mis au point. Ces modèles sont tous des outils précieux qui permettent de découvrir les processus cellulaires liés à la régénération de l’EPR (p. ex., prolifération, différenciation, etc.); cependant, le poisson-zèbre est unique dans sa capacité de réparation intrinsèque de l’EPR après l’ablation.

Bien que la méthodologie ici soit écrite pour se concentrer sur la compréhension des mécanismes à l’origine de la régénération de l’EPR, la lignée Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) et ce protocole d’ablation génétique pourraient être utilisés pour étudier d’autres processus cellulaires tels que l’apoptose de l’EPR, la dégénérescence de l’EPR et l’effet des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents. Le protocole d’ablation peut également être modifié pour inclure la manipulation pharmacologique, qui est une stratégie préliminaire pratique pour dépister les voies de signalisation d’intérêt. Par exemple, il a été démontré que le blocage de la voie Wnt canonique à l’aide de l’inhibiteur de la réponse Wnt-1 (IWR-1)20 altère la régénération del’EPR 3. Cela a été répété ici pour guider les utilisateurs à travers une expérience de manipulation pharmacologique et servir de preuve de concept pour valider un script MATLAB (RpEGEN) créé pour quantifier la régénération RPE basée sur la récupération de la pigmentation. Comme la lignée transgénique et le protocole d’ablation, les scripts RpEGEN sont adaptables et pourraient être utilisés pour quantifier d’autres marqueurs / processus cellulaires au sein de l’EPR.

Protocol

Toutes les méthodologies décrites dans le présent document sont conformes à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Pittsburgh. 1. Préparation avant la collecte d’embryons de poisson zèbre Réglez l’incubateur d’embryons à 28,5 °C. Préparer une solution mère 25x de l’inhibiteur de la mélanogenèse, la N-phénylthiourée (PTU)21,22. Ce…

Representative Results

L’inhibition de la voie canonique de signalisation Wnt est connue pour nuire de manière significative à la régénération de l’EPR du poisson-zèbre en utilisant le paradigme d’ablation génétique (rpe65a:nfsB-eGFP) et la méthodologie de manipulation pharmacologique (IWR-1) décrite dans le protocole3. Cette expérience a été répétée ici pour valider une méthode automatisée de quantification de la régénération RPE du poisson-zèbre basée sur la pigmentation. Les rés…

Discussion

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’EPR et étudie les mécanismes de dégénérescence et de régénération chez les poissons-zèbres d’âge larvaire. Ce protocole a également été réalisé avec succès chez le poisson-zèbre adulte3, mais avec une caractérisation moins étendue, c’est pourquoi les larves sont au centre de l’attention ici. Les aspects critiques de cette partie du protocole (étapes 1 à 4) comprennent: 1) l’ajout de 1,5x PTU aux emb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les travaux décrits ici ont été soutenus par les National Institutes of Health (RO1-EY29410 à J.M.G, et NIH CORE Grant P30-EY08098 au Département d’ophtalmologie); le Centre de transplantation immunitaire et de thérapie upMC (à L.L.L. et J.M.G.); et la Chaire E. Ronald Salvitti en recherche en ophtalmologie (à J.M.G.). Un soutien supplémentaire a été reçu de la bourse Wiegand en ophtalmologie (à L.L.L), de la Fondation Eye & Ear de Pittsburgh et d’une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, New York, NY. Les auteurs tiennent également à remercier Amanda Platt pour son aide technique et le Dr Hugh Hammer et le personnel aquatique pour l’excellent soutien en matière de soins aux animaux.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
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