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Biology

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Abstract

Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich im hinteren Teil des Auges und erfüllt Funktionen, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität benachbarter Netzhaut- und Gefäßgewebe unerlässlich sind. Gegenwärtig hat die begrenzte Reparationskapazität von RPE für Säugetiere, die auf kleine Verletzungen beschränkt ist, Fortschritte beim Verständnis der regenerativen Prozesse von RPE in vivo behindert. Hier wird eine detaillierte Methodik bereitgestellt, um die Untersuchung der In-vivo-RPE-Reparatur unter Verwendung des Zebrafisches zu erleichtern, einem Wirbeltiermodell, das in der Lage ist, eine robuste Geweberegeneration durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein transgenes Nitroreduktase/Metronidazol (NTR/MTZ)-vermitteltes Verletzungsparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), das nach 24-stündiger Behandlung mit MTZ zu einer Ablation der zentralen zwei Drittel der RPE mit anschließender Gewebewiederherstellung führt. Der Schwerpunkt liegt auf RPE-Ablationen in Larvenzebrafischen und es werden auch Methoden zur Prüfung der Auswirkungen pharmakologischer Verbindungen auf die RPE-Regeneration beschrieben. Die Generierung und Validierung von RpEGEN, einem MATLAB-Skript, das zur Automatisierung der Quantifizierung der RPE-Regeneration auf der Grundlage der Pigmentierung erstellt wurde, wird ebenfalls diskutiert. Über aktive RPE-Reparaturmechanismen hinaus kann dieses Protokoll auf Studien zu RPE-Degenerations- und Verletzungsreaktionen sowie zu den Auswirkungen von RPE-Schäden auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe sowie auf andere zelluläre und molekulare Prozesse ausgeweitet werden. Dieses Zebrafischsystem ist vielversprechend bei der Identifizierung von Genen, Netzwerken und Prozessen, die die RPE-Regeneration und RPE-Krankheitsmechanismen vorantreiben, mit dem langfristigen Ziel, dieses Wissen auf Säugetiersysteme und letztendlich auf die therapeutische Entwicklung anzuwenden.

Introduction

Die hierin beschriebene Methodik beschreibt ein Protokoll zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung von Larvenzebrafischen. Die RPE erstreckt sich über den Augenhintergrund und befindet sich zwischen den geschichteten Schichten der neuronalen Netzhaut und der Gefäßschicht, aus der die Aderhaut besteht. Trophische Unterstützung, Absorption von phototoxischem Licht und Aufrechterhaltung von Proteinen des visuellen Zyklus sind nur einige der kritischen Funktionen, die das RPE ausübt, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität dieser benachbarten Gewebe unerlässlichsind 1. Schäden an der RPE von Säugetieren sind reparierbar, wenn die Läsionen klein sind2; Schäden, die durch größere Verletzungen oder fortschreitende degenerative Erkrankungen erlitten werden, sind jedoch irreversibel. Beim Menschen führen degenerative RPE-Erkrankungen (z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Stargardt-Krankheit) zu einem dauerhaften Sehverlust und, da nur wenige Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen, zu einer verminderten Lebensqualität der Patienten. Die begrenzte Fähigkeit von Säugetier-RPE, sich selbst zu reparieren, hat eine Wissenslücke im Bereich der regenerativen RPE-Prozesse geschaffen. Angesichts der robusten Regenerationsfähigkeit des Zebrafisches über viele verschiedene Gewebetypen hinweg wurde dieses Protokoll entwickelt, um ein In-vivo-Wirbeltiersystem zu etablieren, um Studien zur intrinsischen Regeneration von RPE zu erleichtern und Mechanismen aufzudecken, die diese Reaktion antreiben. Unter Verwendung des hier beschriebenen Ablationsparadigmas wurden der kanonische Wnt-Signalweg3, der mTOR-Signalweg4 und die immunbezogenen Reaktionen5 als kritische Mediatoren der RPE-Regeneration identifiziert, wahrscheinlich mit überlappenden Funktionen.

In diesem genetischen Ablationsparadigma exprimieren Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3-Zebrafische das bakteriell abgeleitete Nitroreduktase-Gen (NTR/nfsB)6, das unter Kontrolle des RPE-Enhancer-Elements rpe65a7 mit eGFP verschmolzen ist. Die Ablation wird durch Zugabe des Prodrugs, Metronidazol (MTZ), zu Systemwasser erreicht, das Zebrafische beherbergt. Die intrazelluläre Aktivierung von MTZ durch Nitroreduktase führt zu DNA-Vernetzung und Apoptose in NTR/nfsB-exprimierenden Zellen 8,9. Diese Technologie wurde häufig in Zebrafischen verwendet, um Zellen der Netzhaut10,11,12,13 und anderer Gewebe8 abzutragen. Zusammen ermöglichen diese Elemente die gezielte Expression (rpe65a) einer induzierbaren Zellablationsmethodik (NTR/MTZ)8,9 und eines fluoreszierenden Markers (eGFP) zur Visualisierung.

Es gibt auch andere interessante In-vivo-Modelle, mit denen das regenerative Potenzial des RPE14 untersucht werden kann. Diese sind breit gefächert und umfassen die RPE-zu-Retina-Transdifferenzierung nach der Retinektomie bei Amphibien, bei der RPE-Zellen, die durch das Nachwachsen der Netzhaut verloren gehen,ersetzt werden 15,16; RPE-Wiederherstellung nach der Verletzung in der “super heilenden” MRL/MpJ-Maus17; und exogene Stimulation der RPE-Proliferation in einem Rattenmodell von spontaner RPE und Netzhautdegeneration18, unter anderem. In-vitro-Modelle wie adulte humane RPE-Stammzellen (RPESCs)19 wurden ebenfalls entwickelt. Diese Modelle sind allesamt wertvolle Werkzeuge, um die zellulären Prozesse im Zusammenhang mit der RPE-Regeneration aufzudecken (z. B. Proliferation, Differenzierung usw.); Der Zebrafisch ist jedoch einzigartig in seiner Fähigkeit zur intrinsischen RPE-Reparatur nach der Ablation.

Während die Methodik hier geschrieben wurde, um sich auf das Verständnis der Mechanismen zu konzentrieren, die die RPE-Regeneration antreiben, könnten die Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -Linie und dieses genetische Ablationsprotokoll verwendet werden, um andere zelluläre Prozesse wie RPE-Apoptose, RPE-Degeneration und die Auswirkungen von RPE-Verletzungen auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe zu untersuchen. Das Ablationsprotokoll kann auch modifiziert werden, um pharmakologische Manipulation einzubeziehen, was eine bequeme Vorstrategie zum Screening von Signalwegen von Interesse ist. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Blockierung des kanonischen Wnt-Signalwegs mit Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 die RPE-Regenerationbeeinträchtigt 3. Dies wurde hier wiederholt, um Benutzer durch ein pharmakologisches Manipulationsexperiment zu führen und als Proof-of-Concept zu dienen, um ein MATLAB-Skript (RpEGEN) zu validieren, das zur Quantifizierung der RPE-Regeneration basierend auf der Wiederherstellung der Pigmentierung erstellt wurde. Wie das transgene Linien- und Ablationsprotokoll sind die RpEGEN-Skripte anpassungsfähig und könnten verwendet werden, um andere Marker / zelluläre Prozesse innerhalb der RPE zu quantifizieren.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden entsprechen dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh. 1. Vorbereitung vor der Entnahme von Zebrafischembryonen Stellen Sie den Embryo-Inkubator auf 28,5 ° C ein. Es wird eine 25-fache Stammlösung des Melanogenesehemmers N-Phenylthioharnstoff (PTU)21,22 hergestellt. Diese Stammlösung wird nach einem gängigen Rez…

Representative Results

Es ist bekannt, dass die Hemmung des kanonischen Wnt-Signalwegs die RPE-Regeneration von Zebrafischen unter Verwendung des genetischen Ablationsparadigmas (rpe65a:nfsB-eGFP) und der pharmakologischen Manipulationsmethodik (IWR-1), die im Protokoll3 beschrieben sind, signifikant beeinträchtigt. Dieses Experiment wurde hier wiederholt, um eine automatisierte Methode zur Quantifizierung der RPE-Regeneration von Zebrafischen basierend auf Pigmentierung zu validieren. Die im Folgenden zusamme…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Abrundung der RPE und zur Untersuchung von Degenerations- und Regenerationsmechanismen bei larvengealterten Zebrafischen. Dieses Protokoll wurde auch bei erwachsenenZebrafischen 3 erfolgreich durchgeführt, jedoch mit weniger umfangreicher Charakterisierung, weshalb Larven hier im Mittelpunkt stehen. Zu den kritischen Aspekten dieses Teils des Protokolls (Schritte 1-4) gehören: 1) Zugabe von 1,5x PTU zu Embryonen vor Beginn der Melanogenese…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die hierin beschriebenen Arbeiten wurden von den National Institutes of Health (RO1-EY29410 bis J.M.G. und NIH CORE Grant P30-EY08098 an die Abteilung für Augenheilkunde) unterstützt; das UPMC Immune Transplant & Therapy Center (zu L.L.L. und J.M.G.); und der E. Ronald Salvitti Lehrstuhl für Ophthalmologie Forschung (an J.M.G.). Zusätzliche Unterstützung erhielt die Wiegand Fellowship in Ophthalmology (an L.L.L.), die Eye & Ear Foundation of Pittsburgh und ein uneingeschränktes Stipendium von Research to Prevent Blindness, New York, NY. Die Autoren danken auch Amanda Platt für die technische Unterstützung und Dr. Hugh Hammer und den Aquatics-Mitarbeitern für die hervorragende Unterstützung der Tierpflege.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
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