यह प्रोटोकॉल एक ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश मॉडल का उपयोग करके रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) को आनुवंशिक रूप से कम करने की पद्धति का वर्णन करता है। औषधीय यौगिकों का उपयोग करके सिग्नलिंग पाथवे मॉडुलन को शामिल करने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना व्यापक रूप से विस्तृत है। रंजकता के आधार पर आरपीई पुनर्जनन को परिमाणित करने के लिए एक MATLAB मंच विकसित किया गया था और प्रस्तुत और चर्चा की गई है।
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) आंख के पीछे रहता है और आसन्न रेटिना और संवहनी ऊतकों के स्वास्थ्य और अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक कार्य करता है। वर्तमान में, स्तनधारी आरपीई की सीमित पुनरावृत्ति क्षमता, जो छोटी चोटों तक सीमित है, ने विवो आरपीई पुनर्योजी प्रक्रियाओं में समझने के लिए प्रगति को बाधित किया है। यहां, जेब्राफ़िश का उपयोग करके विवो आरपीई मरम्मत के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान की जाती है, जो मजबूत ऊतक पुनर्जनन में सक्षम एक कशेरुक मॉडल है। यह प्रोटोकॉल एक ट्रांसजेनिक नाइट्रोरिडक्टेस / मेट्रोनिडाज़ोल (एनटीआर / एमटीजेड) – मध्यस्थता चोट प्रतिमान (rpe65a: nfsB-eGFP) का वर्णन करता है, जिसके परिणामस्वरूप एमटीजेड के साथ 24 घंटे के उपचार के बाद आरपीई के केंद्रीय दो-तिहाई का एब्लेशन होता है, बाद में ऊतक वसूली के साथ। लार्वा ज़ेबराफ़िश में आरपीई एब्लेशन पर ध्यान केंद्रित किया जाता है और आरपीई पुनर्जनन पर औषधीय यौगिकों के प्रभावों का परीक्षण करने के तरीकों को भी रेखांकित किया जाता है। RpEGEN की पीढ़ी और सत्यापन, एक MATLAB स्क्रिप्ट रंजकता के आधार पर आरपीई पुनर्जनन के परिमाणीकरण को स्वचालित करने के लिए बनाया गया है, पर भी चर्चा की जाती है। सक्रिय आरपीई मरम्मत तंत्र से परे, इस प्रोटोकॉल को आरपीई अध: पतन और चोट प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के साथ-साथ अन्य सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं के बीच आसन्न रेटिना और संवहनी ऊतकों पर आरपीई क्षति के प्रभावों के अध्ययन के लिए विस्तारित किया जा सकता है। यह ज़ेब्राफ़िश सिस्टम जीन, नेटवर्क और प्रक्रियाओं की पहचान करने में महत्वपूर्ण वादा करता है जो आरपीई पुनर्जनन और आरपीई रोग से संबंधित तंत्र को चलाते हैं, स्तनधारी प्रणालियों के लिए इस ज्ञान को लागू करने के दीर्घकालिक लक्ष्य के साथ और अंततः, चिकित्सीय विकास की ओर।
यहां वर्णित पद्धति लार्वा ज़ेबराफ़िश का उपयोग करके रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) को आनुवंशिक रूप से समाप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण देती है। आरपीई आंख के पीछे तक फैला हुआ है और तंत्रिका रेटिना की स्तरीकृत परतों और कोरॉइड का गठन करने वाले वास्कुलचर की परत के बीच रहता है। ट्रॉफिक समर्थन, फोटोटॉक्सिक प्रकाश का अवशोषण, और दृश्य चक्र प्रोटीन का रखरखाव केवल कुछ महत्वपूर्ण कार्य हैं जो आरपीई प्रदर्शन करता है जो इनआसन्न ऊतकों के स्वास्थ्य और अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। स्तनधारी आरपीई को नुकसान तब पुन: क्षतिदायक होता है जब घाव छोटे होते हैं2; हालांकि, बड़ी चोटों या प्रगतिशील अपक्षयी बीमारी से होने वाली क्षति अपरिवर्तनीय है। मनुष्यों में, आरपीई अपक्षयी रोग (उदाहरण के लिए, उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) और स्टारगार्ड रोग) स्थायी दृष्टि हानि का कारण बनते हैं और, उपलब्ध कुछ उपचार विकल्पों के साथ, जीवन की रोगी की गुणवत्ता में कमी आई है। स्तनधारी आरपीई के लिए आत्म-मरम्मत की सीमित क्षमता ने आरपीई पुनर्योजी प्रक्रियाओं के क्षेत्र में एक ज्ञान अंतर पैदा किया है। कई अलग-अलग ऊतक प्रकारों में ज़ेब्राफ़िश की मजबूत पुनर्योजी क्षमता को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल को आंतरिक रूप से पुन: उत्पन्न करने वाले आरपीई पर अध्ययन की सुविधा के लिए एक इन विवो कशेरुक प्रणाली स्थापित करने और उस प्रतिक्रिया को चलाने वाले तंत्र को उजागर करने के लिए विकसित किया गया था। यहां उल्लिखित एब्लेशन प्रतिमान का उपयोग करते हुए, विहित WNT सिग्नलिंग मार्ग3, एमटीओआर मार्ग4, और प्रतिरक्षा से संबंधित प्रतिक्रियाओं5 को आरपीई पुनर्जनन के महत्वपूर्ण मध्यस्थों के रूप में पहचाना गया है, संभवतः अतिव्यापी कार्यों के साथ।
इस आनुवांशिक एब्लेशन प्रतिमान में, Tg (rpe65a: nfsB-eGFP)3 zebrafish बैक्टीरियल-व्युत्पन्न नाइट्रोरिडक्टेस (NTR / nfsB) जीन6 को व्यक्त करता है जो आरपीई बढ़ाने वाले तत्व के नियंत्रण में ईजीएफपी से जुड़ा हुआ है, rpe65a7। एब्लेशन प्रोड्रग, मेट्रोनिडाज़ोल (एमटीजेड) को सिस्टम वाटर हाउसिंग ज़ेब्राफ़िश में जोड़कर प्राप्त किया जाता है। नाइट्रोरिडक्टेस द्वारा एमटीजेड के इंट्रासेल्युलर सक्रियण के परिणामस्वरूप एनटीआर / एनएफएसबी-व्यक्त कोशिकाओं में डीएनए क्रॉसलिंकिंग और एपोप्टोसिसहोता है। इस तकनीक का व्यापक रूप से ज़ेब्राफ़िश में उपयोग किया गया है ताकि रेटिना10,11,12,13 और अन्य ऊतकों की कोशिकाओं को कम कियाजा सके। साथ में, ये तत्व एक इनड्यूसिबल सेल एब्लेशन पद्धति (NTR / MTZ) 8,9 और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर (eGFP) की लक्षित अभिव्यक्ति (rpe65a) को सक्षम करते हैं।
वीवो मॉडल में अन्य दिलचस्प भी मौजूद हैं जिनका उपयोग आरपीई14 की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। ये व्यापक हैं और उभयचरों में आरपीई-टू-रेटिना ट्रांसडिफरेंशिएशन पोस्ट-रेटिनेक्टोमी शामिल हैं, जिसमें रेटिना रीग्रोथ से खोई आरपीई कोशिकाओं को15,16 को बदल दिया जाता है; “सुपर हीलिंग” MRL / MpJ माउस17 में आरपीई बहाली पोस्ट-चोट; और सहज आरपीई और रेटिना अध: पतन18 के एक चूहे मॉडल में आरपीई प्रसार के बहिर्जात उत्तेजना, दूसरों के बीच में। इन विट्रो मॉडल, जैसे कि वयस्क मानव आरपीई स्टेम सेल (RPESCs) 19 भी विकसित किए गए हैं। ये मॉडल आरपीई पुनर्जनन से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए काम करने वाले सभी मूल्यवान उपकरण हैं (उदाहरण के लिए, प्रसार, भेदभाव, आदि); हालांकि, ज़ेब्राफ़िश आंतरिक आरपीई मरम्मत पोस्ट-एब्लेशन के लिए अपनी क्षमता में अद्वितीय है।
जबकि यहां पद्धति को आरपीई पुनर्जनन चलाने वाले तंत्र को समझने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए लिखा गया है, टीजी (आरपीई 65 ए: एनएफएसबी-ईजीएफपी) लाइन और इस आनुवंशिक एब्लेशन प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे आरपीई एपोप्टोसिस, आरपीई अध: पतन और आसन्न रेटिना और संवहनी ऊतकों पर आरपीई चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एब्लेशन प्रोटोकॉल को औषधीय हेरफेर को शामिल करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, जो ब्याज के सिग्नलिंग मार्गों को स्क्रीन करने के लिए एक सुविधाजनक प्रारंभिक रणनीति है। उदाहरण के लिए, WNT Response-1 (IWR-1)20 के अवरोधक का उपयोग करके विहित WNT मार्ग को अवरुद्ध करना, RPE पुनर्जनन3 को खराब करने के लिए दिखाया गया है। यह एक औषधीय हेरफेर प्रयोग के माध्यम से उपयोगकर्ताओं का मार्गदर्शन करने के लिए यहां दोहराया गया था और रंजकता की वसूली के आधार पर आरपीई उत्थान को मापने के लिए बनाई गई MATLAB स्क्रिप्ट (RpEGEN) को मान्य करने के लिए सबूत-की-अवधारणा के रूप में कार्य करता है। ट्रांसजेनिक लाइन और एब्लेशन प्रोटोकॉल की तरह, RpEGEN स्क्रिप्ट अनुकूलनीय हैं और आरपीई के भीतर अन्य मार्करों / सेलुलर प्रक्रियाओं को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से आरपीई को कम करने और लार्वा-आयु वर्ग के ज़ेब्राफ़िश में अध: पतन और उत्थान के तंत्र का अध्ययन करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल वयस्क ज़ेब्राफ़िश3 मे?…
The authors have nothing to disclose.
यहां वर्णित कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (RO1-EY29410 J.M.G के लिए, और NIH CORE अनुदान P30-EY08098 नेत्र विज्ञान विभाग के लिए); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (L.L.L. और J.M.G. के लिए); और नेत्र विज्ञान अनुसंधान में ई रोनाल्ड सालविटी चेयर (जे.एम.जी. के लिए)। नेत्र विज्ञान में विगैंड फैलोशिप (एलएलएल के लिए), पिट्सबर्ग के आई एंड ईयर फाउंडेशन, और अंधापन, न्यूयॉर्क, एनवाई को रोकने के लिए अनुसंधान से एक अप्रतिबंधित अनुदान से अतिरिक्त समर्थन प्राप्त हुआ था। लेखक भी तकनीकी सहायता के लिए अमांडा प्लैट और उत्कृष्ट पशु देखभाल समर्थन के लिए डॉ ह्यूग हैमर और एक्वाटिक्स स्टाफ को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Lab Material/Equipment | |||
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Software Material | |||
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |