JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Nitroreductase/Metronidazole-Mediert ablasjon og en MATLAB-plattform (RpEGEN) for å studere regenerering av Sebrafish Retinal Pigment Epithelium

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver metodikken for å genetisk fyre opp retinal pigment epitel (RPE) ved hjelp av en transgen sebrafiskmodell. Tilpasning av protokollen for å inkorporere signalveimodulering ved hjelp av farmakologiske forbindelser er omfattende detaljert. En MATLAB-plattform for kvantifisering av RPE-regenerering basert på pigmentering ble utviklet og presentert og diskutert.

Abstract

Retinal pigment epitel (RPE) ligger på baksiden av øyet og utfører funksjoner som er avgjørende for å opprettholde helsen og integriteten til tilstøtende retinal og vaskulært vev. For tiden har den begrensede reparative kapasiteten til pattedyr RPE, som er begrenset til små skader, hindret fremgang i å forstå in vivo RPE regenerative prosesser. Her er det gitt en detaljert metodikk for å lette studiet av in vivo RPE-reparasjon ved hjelp av sebrafisken, en virveldyrmodell som er i stand til robust vevregenerering. Denne protokollen beskriver en transgen nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ)-mediert skadeparadigme (rpe65a:nfsB-eGFP), som resulterer i ablasjon av de sentrale to tredjedeler av RPE etter 24 timers behandling med MTZ, med påfølgende vevsgjenvinning. Fokus er plassert på RPE-ablasjoner i larval sebrafisk og metoder for å teste effekten av farmakologiske forbindelser på RPE-regenerering er også skissert. Generering og validering av RpEGEN, et MATLAB-skript opprettet for å automatisere kvantifisering av RPE-regenerering basert på pigmentering, diskuteres også. Utover aktive RPE-reparasjonsmekanismer kan denne protokollen utvides til studier av RPE-degenerasjon og skaderesponser, samt effekten av RPE-skade på tilstøtende netthinne- og vaskulært vev, blant andre cellulære og molekylære prosesser. Dette sebrafisksystemet har et betydelig løfte om å identifisere gener, nettverk og prosesser som driver RPE-regenerering og RPE sykdomsrelaterte mekanismer, med det langsiktige målet om å anvende denne kunnskapen på pattedyrsystemer og til slutt mot terapeutisk utvikling.

Introduction

Metodikken beskrevet heri beskriver en protokoll for genetisk å fyre opp retinal pigment epitel (RPE) ved hjelp av larval sebrafisk. RPE strekker seg over baksiden av øyet og ligger mellom de stratifiserte lagene i nevral netthinnen og laget av vaskulatur som utgjør koroiden. Trofisk støtte, absorpsjon av fototoksisk lys og vedlikehold av visuelle syklusproteiner er bare noen av de kritiske funksjonene RPE utfører som er avgjørende for å opprettholde helsen og integriteten til disse tilstøtende vevene1. Skade på pattedyr RPE er reparerbar når lesjoner er små2; Imidlertid er skade forårsaket av større skader eller progressiv degenerativ sykdom irreversibel. Hos mennesker fører RPE degenerative sykdommer (f.eks. aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og Stargardt sykdom) til permanent synstap og, med få behandlingsalternativer tilgjengelig, redusert pasientkvalitet på livet. Den begrensede evnen for pattedyr RPE til selvreparasjon har skapt et kunnskapsgap innen RPE regenerative prosesser. Gitt den robuste regenerative kapasiteten til sebrafisken på tvers av mange forskjellige vevstyper, ble denne protokollen utviklet for å etablere et in vivo vertebratsystem for å lette studier på iboende regenerering av RPE og avdekke mekanismer som driver den responsen. Ved hjelp av ablasjonsparadigmet som er skissert her, har den kanoniske Wnt-signalveien3, mTOR-bane4 og immunrelaterte responser5 blitt identifisert som kritiske formidlere av RPE-regenerering, sannsynligvis med overlappende funksjoner.

I dette genetiske ablasjonsparadigmet uttrykker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 sebrafisk det bakterieavledede nitroreductase (NTR/nfsB) gen6 smeltet sammen til eGFP under kontroll av RPE-forsterkerelementet, rpe65a7. Ablasjon oppnås ved å legge til prodrug, metronidazol (MTZ), til systemvannhus sebrafisk. Intracellulær aktivering av MTZ ved nitroreductase resulterer i DNA-krysskobling og apoptose i NTR/nfsB-uttrykkende celler 8,9. Denne teknologien har blitt mye brukt i sebrafisk for å fyre opp celler i netthinnen 10,11,12,13 og andre vev 8. Sammen muliggjør disse elementene målrettet uttrykk (rpe65a) av en induserbar celleablasjonsmetodikk (NTR/MTZ)8,9 og en fluorescerende markør (eGFP) for visualisering.

Andre interessante in vivo-modeller eksisterer også som kan brukes til å studere det regenerative potensialet til RPE14. Disse er brede og inkluderer RPE-til-netthinne transdifferentiation post-retinectomy i amfibier, der RPE celler tapt til retinal gjenvekst erstattes 15,16; RPE restaurering etter skade i “super healing” MRL / MpJ mus17; og eksogen stimulering av RPE-spredning i en rottemodell av spontan RPE og retinal degenerasjon18, blant andre. In vitro-modeller, som voksne humane RPE stamceller (RPESCs)19, er også utviklet. Disse modellene er alle verdifulle verktøy som arbeider for å avdekke cellulære prosesser relatert til RPE-regenerering (f.eks. spredning, differensiering, etc.); Sebrafisken er imidlertid unik i sin kapasitet for egen RPE-reparasjon etter ablasjon.

Mens metodikken her er skrevet for å fokusere på å forstå mekanismene som driver RPE-regenerering, kan Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)- linjen og denne genetiske ablasjonsprotokollen brukes til å studere andre cellulære prosesser som RPE-apoptose, RPE-degenerasjon og effekten av RPE-skade på tilstøtende retinal og vaskulært vev. Ablasjonsprotokollen kan også endres for å inkludere farmakologisk manipulasjon, som er en praktisk foreløpig strategi for å screene signalveier av interesse. For eksempel har blokkering av den kanoniske Wnt-banen ved hjelp av Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 vist seg å svekke RPE-regenerering3. Dette ble gjentatt her for å veilede brukere gjennom et farmakologisk manipulasjonseksperiment og tjene som konseptgodkjenning for å validere et MATLAB-skript (RpEGEN) opprettet for å kvantifisere RPE-regenerering basert på utvinning av pigmentering. I likhet med den transgene linjen og ablasjonsprotokollen, kan RpEGEN-skriptene tilpasses og kan brukes til å kvantifisere andre markører / cellulære prosesser i RPE.

Protocol

Alle metoder som er skissert her, er i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh. 1. Tilberedning før sebrafisk embryosamling Sett embryoinkubatoren til 28,5 °C. Forbered en 25x lagerløsning av melanogenesehemmeren, N-fenylthiourea (PTU)21,22. Denne lagerløsningen er skalert fra en vanlig oppskrift22 og 1x er lik…

Representative Results

Hemming av den kanoniske Wnt-signalveien er kjent for å betydelig svekke sebrafisk RPE-regenerering ved hjelp av det genetiske ablasjonsparadigmet (rpe65a:nfsB-eGFP) og farmakologisk manipulasjonsmetodikk (IWR-1) beskrevet i protokollen3. Dette eksperimentet ble gjentatt her for å validere en automatisert metode for kvantifisering av sebrafisk RPE-regenerering basert på pigmentering. Resultatene oppsummert nedenfor omfattet alle trinnene i protokollen, fra befruktningsdagen (0 dpf) til…

Discussion

Denne protokollen beskriver metodikk for å genetisk fyre opp RPE og studiemekanismer for degenerasjon og regenerering i larve-alderen sebrafisk. Denne protokollen har også blitt utført i voksen sebrafisk3, men med mindre omfattende karakterisering, og derfor er larver fokus her. Kritiske aspekter ved denne delen av protokollen (trinn 1-4) inkluderer: 1) legge 1,5x PTU til embryoer før utbruddet av melanogenese, 2) dechorionating PTU-behandlede embryoer på 2-3 dpf, 3) forsiktig screening for e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbeidet som er beskrevet her, ble støttet av National Institutes of Health (RO1-EY29410 til J.M.G, og NIH CORE Grant P30-EY08098 til Institutt for oftalmologi); UPMC immuntransplantasjons- og terapisenter (til L.L.L. og J.M.G.); og E. Ronald Salvitti-stolen i oftalmologiforskning (til J.M.G.). Ytterligere støtte ble mottatt fra Wiegand Fellowship i Oftalmologi (til L.L.L), Eye &Ear Foundation of Pittsburgh, og et ubegrenset stipend fra Research to Prevent Blindness, New York, NY. Forfattere ønsker også å takke Amanda Platt for teknisk assistanse og Dr. Hugh Hammer og vannpersonalet for utmerket dyrepleiestøtte.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub – ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Keywords: ZebrafishRetinal Pigment EpitheliumRPERegenerationNitroreductaseMetronidazoleMATLABRpEGENAblationTransgenicEGFPPTUPharmacological Treatment
check_url/63658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image