ऊतक समाशोधन के बाद 3 डी पुनर्निर्माण दृष्टिकोण का उपयोग करके माउस छेदक में लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं का पता लगाना और मात्रा निर्धारित करना
Summary
माउस छेदक में इसके स्टेम सेल आला में मूल्यवान लेबल-रिटेनिंग कोशिकाएं होती हैं। हमारे पास लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं का निष्पक्ष रूप से पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने का एक नया तरीका है; हमारे अध्ययन ने जबड़े के पीईजीएएस ऊतक को साफ करने के बाद ईडीयू लेबलिंग और 3 डी पुनर्निर्माण दृष्टिकोण का उपयोग किया।
Abstract
मुराइन छेदक एक अंग है जो माउस के पूरे जीवनकाल में लगातार बढ़ता है। छेदक के समीपस्थ ऊतकों में रहने वाली उपकला और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं संतान को जन्म देती हैं जो एमेलोब्लास्ट्स, ओडोंटोब्लास्ट्स और लुगदी फाइब्रोब्लास्ट में अंतर करेंगी। ये कोशिकाएं छेदक ऊतकों के निरंतर कारोबार का समर्थन करने में महत्वपूर्ण हैं, जिससे वयस्क स्टेम कोशिकाओं के होमियोस्टैसिस का अध्ययन करने के लिए मुराइन छेदक एक उत्कृष्ट मॉडल बन जाता है। माना जाता है कि स्टेम कोशिकाओं में लंबे समय तक रहने वाली क्विसेंट कोशिकाएं होती हैं जिन्हें न्यूक्लियोटाइड एनालॉग जैसे 5-एथिनाइल -2′-डीऑक्स्यूरिडाइन (ईडीयू) द्वारा लेबल किया जा सकता है। कोशिकाएं समय के साथ इस लेबल को बनाए रखती हैं और तदनुसार लेबल-रिटेनिंग सेल (एलआरसी) नाम दिया जाता है। विवो में एलआरसी की कल्पना करने के लिए दृष्टिकोण स्टेम सेल होमियोस्टेसिस की निगरानी के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करते हैं। इस अध्ययन में, हमने एलआरसी की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। हमारे अभिनव दृष्टिकोण में ऊतक समाशोधन और पूरे-माउंट ईडीयू धुंधला होने के बाद माउस छेदक में एलआरसी शामिल हैं, जिसके बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ 3-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण होता है। यह विधि अनुभागित स्लाइडों पर पारंपरिक एलआरसी विश्लेषण की तुलना में 3 डी इमेजिंग अधिग्रहण और गैर-पक्षपाती मात्रा को सक्षम करती है।
Introduction
लगातार बढ़ते माउस छेदक वयस्क स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। उपकला (लैबियल और लिंगुअल ग्रीवा लूप) और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं (लैबियल और लिंगुअल ग्रीवा लूप के बीच) जो छेदक के समीपस्थ पक्ष पर रहते हैं, एमेलोब्लास्ट्स, ओडोंटोब्लास्ट्स और दंत लुगदी कोशिकाओं में अंतर करते हैं। यह अनूठी प्रक्रिया ऊतक हानि और टर्नओवर 2 के मुआवजे के लिए कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करतीहै। हालांकि कई स्टेम सेल मार्कर जैसे कि Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1, आदि। माउस छेदक में वयस्क स्टेम कोशिकाओं के उपसमुच्चय के लिए विवो में पहचाना गया है, वे अकेलेउपयोग किए जाने पर स्टेम सेल आबादी का प्रतिनिधित्व करने में अपर्याप्त हैं। न्यूक्लियोटाइड एनालॉग डीएनए लेबलिंग और प्रतिधारण द्वारा लंबे समय तक जीवित रहने वाली क्विसेंट कोशिकाओं की कल्पना वयस्क स्टेम कोशिकाओं के अधिकांश उप-समूहों के लिए निष्पक्ष पहचान प्रदान कर सकतीहै। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण सेल व्यवहार और दंत स्टेम सेल आबादी के होमियोस्टैसिसको समझने के लिए कई स्टेम सेल पहचान विधियों के बीच उपयोगी है। जबकि विभाजित स्टेम कोशिकाएं काफी पीछा करने के बाद अपना डीएनए लेबलिंग खो देंगी, कथित क्विसेंट स्टेम कोशिकाएं अपने डीएनए लेबल को बनाए रखती हैं, उन्हें लेबल-रिटेनिंग सेल (एलआरसी) 6 मानती हैं। गैर-विभाजित स्टेम कोशिकाओं द्वारा डीएनए लेबलिंग और प्रतिधारण उनके आला में कथित वयस्क स्टेम कोशिकाओं को चिह्नित और पता लगाएगा।
पिछले वर्षों में, थाइमिडीन एनालॉग 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडाइन (बीआरडीयू) लेबलिंग ने सेल प्रसार के लिए बोझिल, समय लेने वाली और उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी असंगत 3एच-थाइमिडीन डीएनए लेबलिंग विधिको बदल दिया। हाल के वर्षों में, 5-एथिनाइल -2′-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) लेबलिंग तकनीक का बीआरडीयू पर तेजी से उपयोग किया गया है। यह पैटर्न कई कारणों से उभरा। सबसे पहले, बीआरडीयू विधि धीमी और श्रम-गहन है। उपयोगकर्ता की स्थिति परिवर्तनशील है, और यह नमूनों में अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करने में असमर्थ है (डीएनए विकृतीकरण के कारण)। इसी तरह, बीआरडीयू विधि कोशिकाओं की एंटीजेनिसिटी को खो देती है, इस प्रकार यह डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण और सह-स्थानीयकरण प्रयोगों और विवो स्टेम सेल प्रत्यारोपण 3,7,9,10,11,12 के लिए अक्षम हो जाती है। बीआरडीयू भी एक टेराटोजेन है, जोभ्रूण के विकास में एलआरसी लेबलिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, पूरे माउंट नमूनों में उपयोग किए जाने पर बीआरडीयू विधि अक्षम है। नुकसान नमूनों के गहरे हिस्से में एंटीबॉडी का कम प्रवेश या गहरे प्रवेश के लिए एक लंबी एंटीबॉडी इनक्यूबेशन अवधि की आवश्यकताहै। ईडीयू लेबलिंग नमूनों को विकृत करने के चरणों से बचता है, इस प्रकार अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करता है। यह सुविधा डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण जैसे सह-स्थानीयकरण प्रयोगों और स्टेम सेल प्रत्यारोपण11,12 के लिए फायदेमंद है। इसके अलावा, ईडीयू लेबलिंग अत्यधिक संवेदनशील और तेज है; क्यू (आई) -उत्प्रेरित [3 + 2] साइक्लोडिशन प्रतिक्रिया (“क्लिक” रसायन विज्ञान) 14 के माध्यम से ईडीयू लेबल का पता लगाने के लिए तेजी से अवशोषित और छोटे आकार के फ्लोरोसेंट एज़ाइड के उपयोग के कारण नमूना प्रवेश अधिक है।
एक और तेजी से लागू डीएनए लेबलिंग विधि इंजीनियर ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग है। ये चूहे हिस्टोन 2 बी ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एच 2 बी-जीएफपी) को टेट्रासाइक्लिन-उत्तरदायी नियामक तत्व 5,14 द्वारा नियंत्रित करते हैं। चूहों को 4 सप्ताह से 4 महीने की पीछा अवधि के लिए टेट्रासाइक्लिन चाउ / पानी के साथ खिलाने के बाद, जीएफपी फ्लोरेसेंस साइकिलिंग कोशिकाओं में कम हो जाएगा और केवल एलआरसी प्रतिदीप्ति6 को बनाए रखते हैं। इस विधि का लाभ यह है कि लेबल किए गए एलआरसी को अलग किया जा सकता है और सेल संस्कृति या डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण 6,7 के लिए व्यवहार्य रह सकता है। कुछ अध्ययनों ने दीर्घकालिक उपयोग के लिए पीछा किए जाने पर क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं के गलत लेबलिंग की सूचना दी। यह परिणाम एच 2 बी-जीएफपी तनाव से लीक पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति के कारण था और उपयुक्त टेट्रासाइक्लिन-विनियमित प्रतिक्रिया15 नहीं था।
इसके अलावा, अतीत में अधिकांश साहित्य ने एलआरसी का पता लगाने का उपयोग मुख्य रूप से अनुभागित स्लाइडों पर किया था, जो दो आयामी हैं और अक्सर एलआरसी के सटीक स्थान और संख्या को दिखाने में गलती से पक्षपाती होते हैं। दृष्टिकोण ने जटिल ऊतक संरचनाओं के वर्गों के लिए गलत कोण प्रदर्शितकिए। अन्य विधि सीरियल अनुभागों से 3 डी छवियां प्राप्त करना और पोस्ट-इमेज पुनर्निर्माण करना था। संपीड़ित या विस्तारित अनुभागों के कारण प्रत्येक सीरियल अनुभाग में भिन्नताओं से छवि विरूपण के कारण ये कदम गलत थे, जिसके परिणामस्वरूप जानकारीगायब थी 16,17,18. विधि भी श्रमसाध्य और समय लेने वाली थी।
एलआरसी के पूरे माउंट इमेजिंग को सुविधाजनक बनाने के लिए, नमूनों को स्पष्ट करने की आवश्यकता है, जबकि प्रतिदीप्ति को अच्छी तरह से बनाए रखा जाना चाहिए। वर्तमान ऊतक समाशोधन तकनीकों को तीन प्रमुख श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: कार्बनिक विलायक-आधारित ऊतक समाशोधन तकनीक, जलीय अभिकर्मक-आधारित ऊतक समाशोधन तकनीक, और हाइड्रोगेल-आधारित ऊतक समाशोधन तकनीक17,19। पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) से जुड़े विलायक प्रणाली (पीईजीएएस) को हाल ही में विकसित किया गया है। यह दृष्टिकोण लगभग सभी प्रकार के ऊतकों को पारदर्शी बनाता है और अंतर्जात प्रतिदीप्ति को संरक्षित करता है, जिसमें हड्डी और दांत जैसे कठोर ऊतकशामिल हैं। पीईजीएएस विधि में अन्य ऊतक समाशोधन विधियों पर फायदे हैं, खासकर दांत और हड्डी सामग्री को साफ करने में। अधिकांश अन्य विधियां केवल आंशिक रूप से कठोर ऊतकों को साफ कर सकती हैं, लंबे प्रसंस्करण समयहो सकते हैं, या महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, पीईजीएएस विधि अन्य तरीकों पर अंतर्जात प्रतिदीप्ति को कुशलतापूर्वक संरक्षित कर सकती है।
इस साहित्य ने हमें सेल अध्ययन के लिए एक नई विधि बनाने के लिए प्रेरित किया। हमने ऊतक-साफ़ नमूनों के सबसे बेहतर 3 डी होल-माउंट इमेजिंग के साथ ईडीयू लेबलिंग के एलआरसी डिटेक्शन फायदों को जोड़ा; नमूने उन्नत पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (पीईजी) से जुड़े विलायक प्रणाली (पीईजीओएस) ऊतक समाशोधन तकनीक15 के साथ संसाधित किए गए थे। हार्ड टिशू पारदर्शिता ने हमें दांतों या जबड़े को तोड़ने के बिना विवो में एलआरसी फ्लोरेसेंस के 3 डी सिग्नल का पुनर्निर्माण करने में सक्षम बनाया, जिससे एलआरसी की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने का अधिक सटीक तरीका बन गया।
इस अध्ययन में, हम माउस छेदक में एलआरसी की कल्पना करने के लिए एक अभिनव मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं। हमने माउस छेदक स्टेम सेल आला के भीतर एलआरसी के स्थान और मात्रा को निर्धारित करने के लिए एक 3 डी दृश्य दृष्टिकोण बनाया। इस परियोजना में ईडीयू लेबलिंग, पीईजीएएस ऊतक समाशोधन तकनीक और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। पूरे माउंट ऊतक पर एलआरसी को ईडीयू लेबल करने की हमारी विधि और एक साफ और पारदर्शी नमूने का उपयोग पारंपरिक अनुभागित स्लाइड और अन्य हानिकारक डीएनए लेबलिंग विधियों की सीमाओं दोनों को दूर करता है। इस प्रकार, हमारी तकनीक स्टेम सेल होमियोस्टैसिस पर अध्ययन के लिए उपयुक्त होगी, जिसमें एलआरसी का पता लगाने की आवश्यकता होती है, खासकर कठोर ऊतकों पर। प्रोटोकॉल अन्य ऊतकों और अंगों में स्टेम सेल होमियोस्टैसिस पर ध्यान केंद्रित करने वालों के लिए समान रूप से फायदेमंद हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इंजेक्शन की कई खुराक (बीआरडीयू, ईडीयू) आमतौर पर बढ़ते नवजात चूहों पर उपयोग की जाती हैं ताकि प्रसार कोशिकाओं को यथासंभव लेबल किया जा सके 1,6,13। पीछा करने की अवधि को ऊतकों ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के संपादन के लिए मेघन के होल्ट को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को एनआईएच / एनआईडीसीआर अनुदान डीई026461 और डीई028345 और टेक्सास ए एंड एम स्कूल ऑफ डेंटिस्ट्री से डॉ ज़ियाओफांग वांग को स्टार्टअप फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
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