Fabbricazione di chip micro-patterned con spessore controllato per microscopia elettronica criogenica ad alta produttività
Summary
Un chip micro-modellato di nuova concezione con finestre di ossido di grafene viene fabbricato applicando tecniche di sistema microelettromeccanico, consentendo l’imaging criogenico al microscopio elettronico efficiente e ad alto rendimento di varie biomolecole e nanomateriali.
Abstract
Una delle principali limitazioni per l’analisi efficiente e ad alto rendimento della struttura delle biomolecole utilizzando la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) è la difficoltà di preparare campioni crio-EM con spessore di ghiaccio controllato su scala nanometrica. Il chip a base di silicio (Si), che ha una serie regolare di micro-fori con finestra di ossido di grafene (GO) modellata su un film di nitruro di silicio (SixNy) a spessore controllato, è stato sviluppato applicando tecniche di sistema microelettromeccanico (MEMS). La fotolitografia UV, la deposizione chimica da vapore, l’incisione a umido e a secco del film sottile e la fusione a goccia di materiali nanofogli 2D sono state utilizzate per la produzione di massa dei chip micro-modellati con finestre GO. La profondità dei microfori è regolata per controllare lo spessore del ghiaccio su richiesta, a seconda delle dimensioni del campione per l’analisi crio-EM. L’affinità favorevole di GO verso le biomolecole concentra le biomolecole di interesse all’interno del micro-foro durante la preparazione del campione crio-EM. Il chip micro-modellato con finestre GO consente l’imaging crio-EM ad alto rendimento di varie molecole biologiche e nanomateriali inorganici.
Introduction
La microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) è stata sviluppata per risolvere la struttura tridimensionale (3D) delle proteine nel loro stato nativo 1,2,3,4. La tecnica prevede il fissaggio di proteine in uno strato sottile (10-100 nm) di ghiaccio vitreo e l’acquisizione di immagini di proiezione di proteine orientate casualmente utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM), con il campione mantenuto a temperatura di azoto liquido. Migliaia o milioni di immagini di proiezione vengono acquisite e utilizzate per ricostruire una struttura 3D della proteina mediante algoritmi computazionali 5,6. Per un’analisi di successo con crio-EM, la preparazione del criocampione è stata automatizzata congelando a immersione l’apparecchiatura che controlla le condizioni di blotting, l’umidità e la temperatura. La soluzione campione viene caricata su una griglia TEM con una membrana di carbonio bucato, successivamente cancellata per rimuovere la soluzione in eccesso, e quindi congelata a immersione con etano liquido per produrre ghiaccio sottile e vitreo 1,5,6. Con i progressi nella crio-EM e l’automazione della preparazione del campione7, il cryo-EM è stato sempre più utilizzato per risolvere la struttura delle proteine, comprese le proteine dell’involucro per i virus e le proteine del canale ionico nella membrana cellulare 8,9,10. La struttura delle proteine dell’involucro delle particelle virali patogene è importante per comprendere la patologia dell’infezione virale, nonché per sviluppare il sistema di diagnosi e i vaccini, ad esempio SARS-CoV-211, che ha causato la pandemia di COVID-19. Inoltre, le tecniche crio-EM sono state recentemente applicate alle scienze dei materiali, come per l’imaging di materiali sensibili al fascio utilizzati nelle batterie 12,13,14 e nei sistemi catalitici 14,15 e l’analisi della struttura dei materiali inorganici nello stato di soluzione16.
Nonostante i notevoli sviluppi nella crio-EM e nelle tecniche pertinenti, esistono limitazioni nella preparazione del criocampione, ostacolando l’analisi della struttura 3D ad alto rendimento. Preparare un film di ghiaccio vitreo con spessore ottimale è particolarmente importante per ottenere la struttura 3D di materiali biologici con risoluzione atomica. Il ghiaccio deve essere abbastanza sottile da ridurre al minimo il rumore di fondo degli elettroni dispersi dal ghiaccio e da vietare sovrapposizioni di biomolecole lungo il percorso del fascio di elettroni 1,17. Tuttavia, se il ghiaccio è troppo sottile, può causare l’allineamento delle molecole proteiche negli orientamenti preferiti o la denaturazione 18,19,20. Pertanto, lo spessore del ghiaccio vitreo dovrebbe essere ottimizzato in base alle dimensioni del materiale di interesse. Inoltre, è in genere necessario un grande sforzo per la preparazione del campione e lo screening manuale dell’integrità del ghiaccio e delle proteine sulle griglie TEM preparate. Questo processo richiede molto tempo, il che ne ostacola l’efficienza per l’analisi della struttura 3D ad alto rendimento. Pertanto, i miglioramenti nell’affidabilità e nella riproducibilità della preparazione del campione crio-EM migliorerebbero l’utilizzo del crio-EM nella biologia strutturale e nella scoperta di farmaci commerciali, nonché per la scienza dei materiali.
Qui, introduciamo processi di microfabbricazione per la realizzazione di un chip micro-modellato con finestre di ossido di grafene (GO) progettate per crio-EM ad alto rendimento con spessore di ghiaccio controllato21. Il chip micro-modellato è stato fabbricato utilizzando tecniche di sistema microelettromeccanico (MEMS), che possono manipolare la struttura e le dimensioni del chip a seconda degli scopi di imaging. Il chip micro-modellato con finestre GO ha una struttura a micro pozzetto che può essere riempita con la soluzione campione e la profondità del microwell può essere regolata per controllare lo spessore del ghiaccio vitreo. La forte affinità di GO per le biomolecole aumenta la concentrazione di biomolecole per la visualizzazione, migliorando l’efficienza dell’analisi della struttura. Inoltre, il chip micro-modellato è composto da un telaio Si, che fornisce un’elevata stabilità meccanica per la griglia19, rendendolo ideale per la gestione del chip durante le procedure di preparazione del campione e l’imaging crio-EM. Pertanto, un chip micro-modellato con finestre GO fabbricate con tecniche MEMS fornisce affidabilità e riproducibilità della preparazione del campione crio-EM, che può consentire un’analisi della struttura efficiente e ad alto rendimento basata su cryo-EM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui vengono introdotti i processi di microfabbricazione per la produzione di chip micro-modellati con finestre GO. Il chip micro-modellato fabbricato è progettato per regolare lo spessore dello strato di ghiaccio vitreo controllando la profondità del microforo con finestre GO a seconda delle dimensioni del materiale da analizzare. Un chip micro-modellato con finestre GO è stato fabbricato utilizzando una serie di tecniche MEMS e un metodo di trasferimento di nanofogli 2D (Figura 1). Il pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-H.K., S.K., M.L. e J.P. riconoscono il sostegno finanziario dell’Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. e J.P. riconoscono il sostegno finanziario del Creative-Pioneering Researchers Program attraverso la Seoul National University (2021) e la sovvenzione NRF finanziata dal governo coreano (MSIT; Concessione Nos. NRF-2020R1A2C2101871 e NRF-2021M3A9I4022936). M.L. e J.P. riconoscono il sostegno finanziario della POSCO Science Fellowship della POSCO TJ Park Foundation e la sovvenzione NRF finanziata dal governo coreano (MSIT; Concessione n. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. riconosce il sostegno finanziario della sovvenzione NRF finanziata dal governo coreano (MSIT; Concessione n. NRF-2020R1A6C101A183) e i programmi di iniziative di ricerca interdisciplinare del College of Engineering e del College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. riconosce il sostegno finanziario della sovvenzione NRF finanziata dal governo coreano (MSIT; Concessione n. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Gli autori ringraziano lo staff e l’equipaggio del Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) per i loro instancabili sforzi e la perseveranza con gli esperimenti crio-EM. Gli autori ringraziano S. J. Kim del National Center for Inter-university Research Facilities per l’assistenza con gli esperimenti FIB-SEM.
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
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