Tillverkning av mikromönstrat chip med kontrollerad tjocklek för kryogen elektronmikroskopi med hög genomströmning

Summary

Ett nyutvecklat mikromönstrat chip med grafenoxidfönster tillverkas genom att tillämpa mikroelektromekaniska systemtekniker, vilket möjliggör effektiv och högkapacitet kryogen elektronmikroskopiavbildning av olika biomolekyler och nanomaterial.

Abstract

En viktig begränsning för effektiv strukturanalys med hög genomströmning av biomolekyler med kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) är svårigheten att förbereda kryo-EM-prover med kontrollerad istjocklek på nanoskalan. Det kisel (Si)-baserade chipet, som har en vanlig uppsättning mikrohål med grafenoxidfönster (GO) mönstrat på en tjocklekskontrollerad kiselnitridfilm (Si_xN_y), har utvecklats genom att tillämpa mikroelektromekaniska system (MEMS) tekniker. UV-fotolitografi, kemisk ångavsättning, våt och torr etsning av den tunna filmen och droppgjutning av 2D-nanoarkmaterial användes för massproduktion av de mikromönstrade chipsen med GO-fönster. Mikrohålens djup regleras för att kontrollera istjockleken på begäran, beroende på provets storlek för kryo-EM-analys. Den gynnsamma affiniteten hos GO mot biomolekyler koncentrerar biomolekylerna av intresse i mikrohålet under kryo-EM-provberedning. Det mikromönstrade chipet med GO-fönster möjliggör kryo-EM-avbildning med hög genomströmning av olika biologiska molekyler, såväl som oorganiska nanomaterial.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) har utvecklats för att lösa den tredimensionella (3D) strukturen hos proteiner i deras ursprungliga tillstånd 1,2,3,4. Tekniken innebär att proteiner fixeras i ett tunt skikt (10-100 nm) glasartad is och att man får projektionsbilder av slumpmässigt orienterade proteiner med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (TEM), med provet bibehållet vid flytande kvävetemperatur. Tusentals till miljoner projektionsbilder förvärvas och används för att rekonstruera en 3D-struktur av proteinet med hjälp av beräkningsalgoritmer ^5,6. För framgångsrik analys med cryo-EM har kryoprovberedning automatiserats genom att doppa och frysa utrustningen som styr blottingförhållandena, fuktigheten och temperaturen. Provlösningen laddas på ett TEM-rutnät med ett håligt kolmembran, blottas successivt för att avlägsna överskottslösningen och störtfryses sedan med flytande etan för att producera tunn, glasaktig is ^1,5,6. Med framstegen inom kryo-EM och automatiseringen av provberedning⁷ har kryo-EM alltmer använts för att lösa proteinernas struktur, inklusive kuvertproteiner för virus och jonkanalproteiner i cellmembranet ^8,9,10. Strukturen hos kuvertproteiner av patogena viruspartiklar är viktig för att förstå virusinfektionspatologi, liksom för att utveckla diagnossystemet och vaccinerna, t.ex. SARS-CoV-2¹¹, som orsakade COVID-19-pandemin. Dessutom har kryo-EM-tekniker nyligen tillämpats på materialvetenskap, såsom för avbildning av strålkänsliga material som används i batteri 12,13,14 och katalytiska system ^14,15 och analys av strukturen hos oorganiska material i lösningstillstånd¹⁶.

Trots märkbar utveckling inom kryo-EM och relevanta tekniker finns det begränsningar i kryoprovberedning, vilket hindrar 3D-strukturanalys med hög genomströmning. Att förbereda en glasartad isfilm med optimal tjocklek är särskilt viktigt för att erhålla 3D-strukturen hos biologiska material med atomär upplösning. Isen måste vara tillräckligt tunn för att minimera bakgrundsbrus från elektroner som sprids av isen och för att förhindra överlappningar av biomolekyler längs elektronstrålens väg ^1,17. Men om isen är för tunn kan det få proteinmolekyler att anpassa sig i föredragna riktningar eller denaturera 18,19,20. Därför bör tjockleken på glasis optimeras beroende på storleken på materialet av intresse. Dessutom krävs vanligtvis omfattande ansträngningar för provberedning och manuell screening av is- och proteinintegritet på de beredda TEM-gallren. Denna process är extremt tidskrävande, vilket hindrar dess effektivitet för 3D-strukturanalys med hög genomströmning. Därför skulle förbättringar av tillförlitligheten och reproducerbarheten av kryo-EM-provberedning förbättra användningen av kryo-EM i strukturbiologi och kommersiell läkemedelsupptäckt, liksom för materialvetenskap.

Här introducerar vi mikrofabrikationsprocesser för att göra ett mikromönstrat chip med grafenoxidfönster (GO) utformade för kryo-EM med hög genomströmning med kontrollerad istjocklek²¹. Det mikromönstrade chipet tillverkades med hjälp av mikroelektromekaniska systemtekniker (MEMS), som kan manipulera chipets struktur och dimensioner beroende på avbildningsändamålen. Det mikromönstrade chipet med GO-fönster har en mikrowellstruktur som kan fyllas med provlösningen, och mikrobrunnens djup kan regleras för att kontrollera tjockleken på glasisen. Gos starka affinitet för biomolekyler ökar koncentrationen av biomolekyler för visualisering, vilket förbättrar effektiviteten i strukturanalysen. Dessutom består det mikromönstrade chipet av en Si-ram, vilket ger hög mekanisk stabilitet för gallret¹⁹, vilket gör det idealiskt för hantering av chipet under provberedningsförfaranden och kryo-EM-avbildning. Därför ger ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkade av MEMS-tekniker tillförlitlighet och reproducerbarhet för kryo-EM-provberedning, vilket kan möjliggöra effektiv strukturanalys med hög genomströmning baserad på kryo-EM.

Protocol

1. Tillverkning av mikromönstrat chip med GO-fönster (figur 1) Sätt av kiselnitriden.Deponera kiselnitrid med låg spänning (SixNy) på båda sidor av Si-skivan (4 tum diameter och 100 μm tjocklek) med användning av kemisk ångavsättning med lågt tryck (LPCVD) vid 830 °C och ett tryck på 150 mTorr, under ett flöde av 170 sccm diklorsilan (SiH2Cl2, DCS) och 38 sccm ammoniak (NH3</su…

Representative Results

Ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkades genom MEMS-tillverkning och 2D GO nanoarköverföring. Chips för mikromönster massproducerades, med cirka 500 chips producerade från en 4 i skiva (figur 1B och figur 2A, B). Designen av de mikromönstrade chipsen kan manipuleras med olika mönster av krommasken (figur 2) under fotolitografiproceduren. De tillverkade mikromönstrade chipsen hade kontrollerade an…

Discussion

Mikrofabrikationsprocesserna för att producera mikromönstrade chips med GO-fönster introduceras här. Det tillverkade mikromönstrade chipet är utformat för att reglera tjockleken på glasartsskiktet genom att kontrollera mikrohålets djup med GO-fönster beroende på storleken på materialet som ska analyseras. Ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkades med hjälp av en serie MEMS-tekniker och en 2D-nanoarköverföringsmetod (figur 1). Den största fördelen med att använda …

Materials

1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F