Denne biokemiske oprensningsmetode med massespektrometribaseret proteomisk analyse letter den robuste karakterisering af amyloidfibrilkerner, hvilket kan fremskynde identifikationen af mål for forebyggelse af Alzheimers sygdom.
Proteinholdige fibrillære indeslutninger er vigtige patologiske kendetegn ved flere neurodegenerative sygdomme. I de tidlige stadier af Alzheimers sygdom (AD) danner amyloid-beta-peptider protofibriller i det ekstracellulære rum, som fungerer som frø, der gradvist vokser og modnes til store amyloidplakker. På trods af denne grundlæggende forståelse er den nuværende viden om amyloid fibrilstruktur, sammensætning og aflejringsmønstre i hjernen begrænset. En stor barriere har været manglende evne til at isolere højt oprensede amyloidfibriller fra hjerneekstrakter. Affinitetsrensning og laserfangst mikrodissektionsbaserede tilgange er tidligere blevet brugt til at isolere amyloider, men er begrænset af den lille mængde materiale, der kan genvindes. Denne nye, robuste protokol beskriver den biokemiske oprensning af amyloid plaquekerner ved hjælp af natriumdodecylsulfat (SDS) opløses med saccharosedensitetsgradient ultracentrifugering og ultralydbehandling og giver meget rene fibriller fra AD-patienter og AD-model hjernevæv. Massespektrometri (MS)-baseret bottom-up proteomisk analyse af det rensede materiale repræsenterer en robust strategi til at identificere næsten alle de primære proteinkomponenter i amyloidfibriller. Tidligere proteomiske undersøgelser af proteiner i amyloid koronae har afsløret en uventet stor og funktionelt forskelligartet samling af proteiner. Især efter raffinering af oprensningsstrategien blev antallet af co-rensende proteiner reduceret med mere end 10 gange, hvilket indikerer den høje renhed af det isolerede SDS uopløselige materiale. Negativ farvning og immuno-guld elektronmikroskopi tillod bekræftelse af renheden af disse præparater. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå de rumlige og biologiske egenskaber, der bidrager til aflejringen af disse proteiner i amyloidindeslutninger. Samlet set er denne analytiske strategi godt positioneret til at øge forståelsen af amyloidbiologi.
Amyloid er et ekstremt stabilt supramolekylært arrangement, der findes i et forskelligt panel af proteiner, hvoraf nogle fører til patologiske ændringer1. Akkumuleringen af intra- eller ekstracellulære amyloidaggregater observeres i flere neurodegenerative sygdomme2. Amyloidaggregater er heterogene og er beriget med et stort antal proteiner og lipider3. I de senere år har interessen for amyloidproteomet skabt betydelig interesse blandt grundlæggende og translationelle neurovidenskabere. Flere metoder er blevet udviklet til at udtrække og rense amyloidaggregater fra mus og post mortem humane hjernevæv. Laserfangst mikrodissektion, immunoprecipitation, decellularisering og biokemisk isolering af amyloidaggregater er almindeligt anvendte metoder til at ekstrahere og rense amyloidplakker, fibriller og oligomerer 4,5,6,7. Mange af disse undersøgelser har fokuseret på at bestemme proteinsammensætningen af disse tætpakkede fibrillære aflejringer ved hjælp af semikvantitativ MS. De tilgængelige resultater er imidlertid inkonsekvente, og det overraskende store antal co-rensende proteiner, der tidligere er rapporteret, er udfordrende at fortolke.
Den primære begrænsning i den eksisterende litteratur, der beskriver amyloidkerneproteomet i AD- og AD-musemodelhjerner, er, at det oprensede materiale indeholder et uoverskueligt antal samrensende proteiner. Det overordnede mål med denne metode er at overvinde denne begrænsning og udvikle en robust biokemisk oprensning til isolering af amyloidfibrilkerner. Denne strategi anvender en tidligere beskrevet saccharosedensitetsgradient ultracentrifugeringsbaseret biokemisk metode til isolering af SDS uopløselige berigede amyloidfraktioner fra post mortem AD humant og musehjernevæv 8,9. Denne metode bygger på den eksisterende litteratur, men går videre med ultralydbehandling og SDS-vaske for at fjerne de fleste af de løst bundne amyloidassocierede proteiner, hvilket fører til isolering af højt oprensede amyloidfibriller (figur 1). Fibrillerne renset af denne protokol overvinder flere eksisterende udfordringer, der ofte opstår i strukturelle undersøgelser af amyloidfibriller isoleret fra hjerneekstrakter. Visualisering af disse fibriller med transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekræfter integriteten og renheden af det rensede materiale (figur 2). I denne undersøgelse opløses de isolerede fibriller og fordøjes til peptider med trypsin, og etiketfri MS-analyse kan let afsløre identiteten af proteinerne, der danner fibrilkernen. Især har nogle af disse proteiner en iboende tendens til at danne supramolekylære samlinger i ikke-membranbundne organeller. Derudover er mange af de proteiner, der er identificeret i analysen af amyloid-beta (Aβ) fibriller, også forbundet med andre neurodegenerative sygdomme, hvilket tyder på, at disse proteiner kan spille en nøglerolle i flere proteinopatier.
Denne SDS / ultralydbehandlingsmetode vil sandsynligvis ikke ændre eller forstyrre strukturen af fibrilkernerne. Det rensede materiale er også velegnet til en bred vifte af top-down og bottom-up proteomiske analysemetoder og yderligere MS-baserede strukturelle analysestrategier, såsom kemisk tværbinding eller hydrogen-deuteriumudveksling. Den samlede genopretning ved hjælp af denne metode er relativt høj og er således egnet til detaljerede strukturelle undersøgelser, som kræver mikrogram til milligram af det rensede materiale. Det rensede materiale er også velegnet til strukturelle undersøgelser ved hjælp af cryoEM og atomkraftmikroskopi. Denne protokol, i kombination med den stabile isotopiske mærkning af pattedyr, kan lette solid-state nukleare magnetiske resonans (NMR) undersøgelser af amyloid struktur10.
Udvikling af en klar forståelse af amyloid struktur og sammensætning er udfordrende for strukturbiologer og biokemikere på grund af de biologiske kompleksiteter og eksperimentelle begrænsninger ved ekstraktion af rensede fibriller fra AD-hjernevæv16,17. Amyloidfibriller er polymorfe på molekylært niveau og viser en heterogen population af varierende længder og kompleksiteter18,19. For bedre at for…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH-bevillingen R01AG061865 til R.J.V. og J.N.S. Forfatterne takker Vassar og Savas forskningsgruppemedlemmer ved Northwestern University for deres tankevækkende diskussioner. Vi takker også oprigtigt Dr (s). Ansgar Seimer og Ralf Langen ved University of South California for deres afgørende input. Vi takker Dr. Farida Korabova for prøveforberedelse og negativ farvning elektronmikroskopi billeddannelse ved Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |