Биохимическая очистка и протеомная характеристика амилоидных ядер Фибриля из головного мозга
Summary
Этот метод биохимической очистки с протеомным анализом на основе масс-спектрометрии облегчает надежную характеристику амилоидных фибровых ядер, что может ускорить идентификацию мишеней для профилактики болезни Альцгеймера.
Abstract
Белковые фибриллярные включения являются ключевыми патологическими признаками множественных нейродегенеративных заболеваний. На ранних стадиях болезни Альцгеймера (БА) бета-амилоидные пептиды образуют протофибриллы во внеклеточном пространстве, которые действуют как семена, которые постепенно растут и созревают в большие амилоидные бляшки. Несмотря на это базовое понимание, современные знания о структуре, составе и моделях осаждения амилоидных фибрилов в мозге ограничены. Одним из основных препятствий была неспособность выделить высокоочищенные амилоидные фибриллы из экстрактов мозга. Подходы на основе аффинной очистки и лазерного захвата на основе микродиссекции ранее использовались для выделения амилоидов, но ограничены небольшим количеством материала, который может быть восстановлен. Этот новый, надежный протокол описывает биохимическую очистку ядер амилоидных бляшек с использованием солюбилизации додецилсульфата натрия (SDS) с ультрацентрифугированием и ультразвуком градиента плотности сахарозы и дает высокочистые фибриллы от пациентов с БА и тканей мозга модели АД. Протеомный анализ очищенного материала на основе масс-спектрометрии (MS) представляет собой надежную стратегию идентификации почти всех первичных белковых компонентов амилоидных фибрилл. Предыдущие протеомные исследования белков в амилоидной короне выявили неожиданно большую и функционально разнообразную коллекцию белков. Примечательно, что после уточнения стратегии очистки количество белков совместной очистки сократилось более чем в 10 раз, что указывает на высокую чистоту изолированного нерастворимого материала SDS. Отрицательное окрашивание и иммунозолотая электронная микроскопия позволили подтвердить чистоту этих препаратов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять пространственные и биологические атрибуты, которые способствуют отложению этих белков в амилоидные включения. Взятые вместе, эта аналитическая стратегия имеет хорошие возможности для повышения понимания биологии амилоида.
Introduction
Амилоид является чрезвычайно стабильным супрамолекулярным расположением, которое содержится в разнообразной панели белков, некоторые из которых приводят к патологическим изменениям1. Накопление внутри- или внеклеточных амилоидных агрегатов наблюдается при нескольких нейродегенеративных заболеваниях2. Амилоидные агрегаты неоднородны и обогащены большим количеством белков и липидов3. В последние годы интерес к амилоидному протеому вызвал значительный интерес среди базовых и трансляционных нейробиологов. Было разработано несколько методов извлечения и очистки амилоидных агрегатов из тканей мозга мыши и посмертного вскрытия человека. Микродиссекция лазерного захвата, иммунопреципитация, децеллюляризация и биохимическая изоляция амилоидных агрегатов являются широко используемыми методами извлечения и очистки амилоидных бляшек, фибрилл и олигомеров 4,5,6,7. Многие из этих исследований были сосредоточены на определении белкового состава этих плотно упакованных фибриллярных отложений с использованием полуколичественного РС. Тем не менее, имеющиеся результаты противоречивы, и удивительно большое количество совместно очищающих белков, о которых сообщалось ранее, трудно интерпретировать.
Основным ограничением существующей литературы, описывающей протеом амилоидного ядра в мозге мышиных моделей AD и AD, является то, что очищенный материал содержит неуправляемое количество совместно очищающих белков. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы преодолеть это ограничение и разработать надежную биохимическую очистку для выделения амилоидных фибрильных кернов. Эта стратегия использует ранее описанный биохимический метод ультрацентрифугирования на основе ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы для выделения нерастворимых амилоидных фракций SDS из посмертных тканей мозга человека и мыши 8,9. Этот метод основан на существующей литературе, но идет дальше с ультразвуком и промывкой SDS для удаления большинства слабо связанных амилоид-ассоциированных белков, что приводит к выделению высокоочищенных амилоидных фибрилл (рисунок 1). Фибриллы, очищенные этим протоколом, преодолевают несколько существующих проблем, часто встречающихся в структурных исследованиях амилоидных фибрилл, выделенных из экстрактов мозга. Визуализация этих фибрилл с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) подтверждает целостность и чистоту очищенного материала (рисунок 2). В этом исследовании изолированные фибриллы солюбилизируются и перевариваются до пептидов с трипсином, а анализ РС без меток может легко выявить идентичность белков, образующих ядро фибрилл. Примечательно, что некоторые из этих белков имеют врожденную тенденцию к образованию супрамолекулярных сборок в немембранных органеллах. Кроме того, многие из белков, идентифицированных при анализе бета-амилоидных (Aβ) фибрилл, также связаны с другими нейродегенеративными заболеваниями, предполагая, что эти белки могут играть ключевую роль в множественных протеинопатиях.
Этот метод SDS/ультразвука вряд ли изменит или нарушит структуру фибрилловых сердечников. Очищенный материал также подходит для широкого спектра подходов к протеомному анализу сверху вниз и снизу вверх и дополнительных стратегий структурного анализа на основе MS, таких как химическое сшивание или водородно-дейтериевый обмен. Общее восстановление с использованием этого метода относительно высокое и, таким образом, подходит для подробных структурных исследований, которые требуют от микрограммов до миллиграммов очищенного материала. Очищенный материал также подходит для структурных исследований с использованием криоЭМ и атомно-силовой микроскопии. Этот протокол в сочетании со стабильной изотопной маркировкой млекопитающих может облегчить исследования твердотельного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) амилоидной структуры10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработка четкого понимания структуры и состава амилоида является сложной задачей для структурных биологов и биохимиков из-за биологических сложностей и экспериментальных ограничений в извлечении очищенных фибрилл из тканей мозга AD16,17. Амилоидные фи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH R01AG061865 R.J.V. и J.N.S. Авторы благодарят членов исследовательской группы Вассара и Саваса в Северо-Западном университете за их вдумчивые дискуссии. Мы также искренне благодарим д-ра(ов). Ансгар Займер и Ральф Ланген из Университета Южной Калифорнии за их важный вклад. Мы благодарим доктора Фариду Корабову за подготовку образцов и электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием в Центре передовой микроскопии Северо-Западного университета.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer’s disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -. X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer’s disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S., Li, K. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer’s disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington’s disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease brain. Alzheimer’s Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer’s β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer’s disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
