Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu
Summary
Kütle spektrometrisine dayalı proteomik analiz ile bu biyokimyasal saflaştırma yöntemi, Alzheimer hastalığını önleme hedeflerinin belirlenmesini hızlandırabilecek amiloid fibril çekirdeklerinin sağlam karakterizasyonunu kolaylaştırır.
Abstract
Proteinli fibriller inklüzyonlar çoklu nörodejeneratif hastalıkların anahtar patolojik özellikleridir. Alzheimer hastalığının (AD) erken evrelerinde, amiloid-beta peptitleri, hücre dışı boşlukta, yavaş yavaş büyüyen ve büyük amiloid plaklara olgunlaşan tohumlar gibi davranan protofibriller oluşturur. Bu temel anlayışa rağmen, beyindeki amiloid fibril yapısı, bileşimi ve biriktirme kalıpları hakkındaki mevcut bilgiler sınırlıdır. En büyük engellerden biri, yüksek oranda saflaştırılmış amiloid fibrillerinin beyin ekstraktlarından izole edilememesi olmuştur. Afinite saflaştırma ve lazer yakalama mikrodiseksiyon tabanlı yaklaşımlar daha önce amiloidleri izole etmek için kullanılmıştır, ancak geri kazanılabilecek az miktarda malzeme ile sınırlıdır. Bu yeni, sağlam protokol, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözünürlüğü kullanılarak sodyum dodesil sülfat (SDS) çözünürlüğü kullanılarak amiloid plak çekirdeklerinin biyokimyasal saflaştırılmasını açıklar ve sakkaroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ve ultrasonikasyon ile AD hastalarından ve AD model beyin dokularından oldukça saf fibriller verir. Saflaştırılmış malzemenin kütle spektrometresi (MS) tabanlı aşağıdan yukarıya proteomik analizi, amiloid fibrillerin neredeyse tüm birincil protein bileşenlerini tanımlamak için sağlam bir stratejiyi temsil eder. Amiloid koronadaki proteinlerin önceki proteomik çalışmaları, beklenmedik derecede büyük ve işlevsel olarak çeşitli protein koleksiyonunu ortaya çıkarmıştır. Özellikle, saflaştırma stratejisini rafine ettikten sonra, birlikte saflaştırıcı proteinlerin sayısı, izole SDS çözünmeyen malzemenin yüksek saflığını gösteren 10 kattan fazla azaltılmıştır. Negatif boyama ve immüno-altın elektron mikroskopisi, bu preparatların saflığının doğrulanmasına izin verdi. Bu proteinlerin amiloid kapanımlarına birikmesine katkıda bulunan mekansal ve biyolojik özellikleri anlamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Birlikte ele alındığında, bu analitik strateji amiloid biyolojisinin anlaşılmasını arttırmak için iyi konumlandırılmıştır.
Introduction
Amiloid, bazıları patolojik değişikliklere yol açan çeşitli protein panellerinde bulunan son derece kararlı bir supramoleküler düzenlemedir1. Hücre içi veya hücre dışı amiloid agregaların birikmesi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda gözlenir2. Amiloid agregaları heterojendir ve çok sayıda protein ve lipit ile zenginleştirilmiştir3. Son yıllarda, amiloid proteomuna olan ilgi, temel ve translasyonel sinirbilimciler arasında önemli bir ilgi yaratmıştır. Amiloid agregalarını fare ve ölüm sonrası insan beyin dokularından çıkarmak ve saflaştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu, immünopresipitasyon, desellülarizasyon ve amiloid agregaların biyokimyasal izolasyonu, amiloid plakları, fibriller ve oligomerleri çıkarmak ve saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir 4,5,6,7. Bu çalışmaların çoğu, yarı kantitatif MS kullanarak sıkıca paketlenmiş bu fibriller birikintilerin protein bileşimini belirlemeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, mevcut sonuçlar tutarsızdır ve daha önce bildirilen şaşırtıcı derecede çok sayıda ortak saflaştırıcı proteinin yorumlanması zordur.
AD ve AD fare modeli beyinlerde amiloid çekirdek proteomunu tanımlayan mevcut literatürün birincil sınırlaması, saflaştırılmış materyalin yönetilemeyen sayıda birlikte saflaştırıcı protein içermesidir. Bu yöntemin genel amacı, bu sınırlamanın üstesinden gelmek ve amiloid fibril çekirdeklerini izole etmek için sağlam bir biyokimyasal saflaştırma geliştirmektir. Bu strateji, SDS’nin çözünmez zenginleştirilmiş amiloid fraksiyonlarının ölüm sonrası AD insan ve fare beyin dokularından izolasyonu için daha önce tanımlanmış bir sakkaroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme bazlı biyokimyasal yöntem kullanmaktadır 8,9. Bu yöntem mevcut literatüre dayanmaktadır, ancak ultrasonikasyon ve SDS ile daha da ileri giderek, gevşek bağlı amiloid ile ilişkili proteinlerin çoğunu çıkarmak için yıkanır ve yüksek oranda saflaştırılmış amiloid fibrillerin izolasyonuna yol açar (Şekil 1). Bu protokol ile saflaştırılan fibriller, beyin ekstraktlarından izole edilen amiloid fibrillerin yapısal çalışmalarında sıklıkla karşılaşılan çeşitli mevcut zorlukların üstesinden gelir. Bu fibrillerin transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirilmesi, saflaştırılmış malzemenin bütünlüğünü ve saflığını doğrular (Şekil 2). Bu çalışmada, izole fibriller çözülür ve tripsin ile peptitlere sindirilir ve etiketsiz MS analizi, fibril çekirdeğini oluşturan proteinlerin kimliğini kolayca ortaya çıkarabilir. Özellikle, bu proteinlerin bazıları, zara bağlı olmayan organellerde supramoleküler gruplar oluşturma eğilimindedir. Ek olarak, amiloid-beta (Aβ) fibrillerinin analizinde tanımlanan proteinlerin çoğu, diğer nörodejeneratif hastalıklarla da ilişkilidir, bu da bu proteinlerin çoklu proteinopatilerde önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.
Bu SDS / ultrasonikasyon yönteminin fibril çekirdeklerin yapısını değiştirmesi veya bozması muhtemel değildir. Saflaştırılmış malzeme ayrıca çok çeşitli yukarıdan aşağıya ve aşağıdan yukarıya proteomik analiz yaklaşımları ve kimyasal çapraz bağlama veya hidrojen-döteryum değişimi gibi ek MS tabanlı yapısal analiz stratejileri için de uygundur. Bu yöntemi kullanarak genel iyileşme nispeten yüksektir ve bu nedenle, saflaştırılmış malzemenin miligramlarına mikrogram gerektiren ayrıntılı yapısal çalışmalar için uygundur. Saflaştırılmış malzeme ayrıca kriyoEM ve atomik kuvvet mikroskobu kullanan yapısal çalışmalar için de uygundur. Bu protokol, memelilerin kararlı izotopik etiketlemesi ile birlikte, amiloid yapısı10’un katı hal nükleer manyetik rezonans (NMR) çalışmalarını kolaylaştırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amiloid yapısı ve bileşimi hakkında net bir anlayış geliştirmek, AD beyin dokularından saflaştırılmış fibrillerin çıkarılmasındaki biyolojik karmaşıklıklar ve deneysel sınırlamalar nedeniyle yapısal biyologlar ve biyokimyacılar için zordur16,17. Amiloid fibriller moleküler düzeyde polimorfiktir ve farklı uzunluklarda ve karmaşıklıklarda heterojen bir popülasyon gösterir18,19</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, R.J.V. ve J.N.S.’ye NIH hibesi R01AG061865 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Northwestern Üniversitesi’ndeki Vassar ve Savas araştırma grubu üyelerine düşünceli tartışmaları için teşekkür ediyor. Ayrıca Dr. (ler) e içtenlikle teşekkür ederiz. Güney Kaliforniya Üniversitesi’nden Ansgar Seimer ve Ralf Langen, önemli girdileri için. Northwestern Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi’nde numune hazırlama ve negatif boyama elektron mikroskobu görüntülemesi için Dr. Farida Korabova’ya teşekkür ederiz.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer’s disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -. X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer’s disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S., Li, K. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer’s disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington’s disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease brain. Alzheimer’s Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer’s β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer’s disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
