मस्तिष्क से एमिलॉयड फाइब्रिल कोर के जैव रासायनिक शुद्धिकरण और प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन
Summary
मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ यह जैव रासायनिक शुद्धि विधि अमाइलॉइड फाइब्रिल कोर के मजबूत लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है, जो अल्जाइमर रोग को रोकने के लिए लक्ष्यों की पहचान में तेजी ला सकती है।
Abstract
प्रोटीनेशियस फाइब्रिलर समावेशन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के प्रमुख रोग हॉलमार्क हैं। अल्जाइमर रोग (एडी) के शुरुआती चरणों में, अमाइलॉइड-बीटा पेप्टाइड्स बाह्य अंतरिक्ष में प्रोटोफिब्रिल बनाते हैं, जो बीज के रूप में कार्य करते हैं जो धीरे-धीरे बड़े अमाइलॉइड सजीले टुकड़े में बढ़ते हैं और परिपक्व होते हैं। इस बुनियादी समझ के बावजूद, मस्तिष्क में अमाइलॉइड फाइब्रिल संरचना, संरचना और जमाव पैटर्न का वर्तमान ज्ञान सीमित है। एक प्रमुख बाधा मस्तिष्क के अर्क से अत्यधिक शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल को अलग करने में असमर्थता रही है। आत्मीयता शुद्धिकरण और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग पहले अमाइलॉइड को अलग करने के लिए किया गया है, लेकिन सामग्री की छोटी मात्रा से सीमित हैं जिन्हें पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। यह उपन्यास, मजबूत प्रोटोकॉल सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और अल्ट्रासोनिकेशन के साथ सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) घुलनशीलता का उपयोग करके एमिलॉयड पट्टिका कोर के जैव रासायनिक शुद्धिकरण का वर्णन करता है और एडी रोगियों और एडी मॉडल मस्तिष्क के ऊतकों से अत्यधिक शुद्ध फाइब्रिल पैदा करता है। शुद्ध सामग्री का मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित बॉटम-अप प्रोटिओमिक विश्लेषण एमिलॉयड फाइब्रिल के लगभग सभी प्राथमिक प्रोटीन घटकों की पहचान करने के लिए एक मजबूत रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। अमाइलॉइड कोरोन में प्रोटीन के पिछले प्रोटिओमिक अध्ययनों से प्रोटीन के अप्रत्याशित रूप से बड़े और कार्यात्मक रूप से विविध संग्रह का पता चला है। विशेष रूप से, शुद्धिकरण रणनीति को परिष्कृत करने के बाद, सह-शुद्ध प्रोटीन की संख्या 10 गुना से अधिक कम हो गई थी, जो पृथक एसडीएस अघुलनशील सामग्री की उच्च शुद्धता का संकेत देती है। नकारात्मक धुंधला और इम्यूनो-गोल्ड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने इन तैयारी की शुद्धता की पुष्टि की अनुमति दी। स्थानिक और जैविक विशेषताओं को समझने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जो इन प्रोटीनों को अमाइलॉइड समावेशन में जमा करने में योगदान करते हैं। एक साथ लिया गया, यह विश्लेषणात्मक रणनीति अमाइलॉइड जीव विज्ञान की समझ बढ़ाने के लिए अच्छी तरह से तैनात है।
Introduction
अमाइलॉइड एक अत्यंत स्थिर सुपरमॉलिक्युलर व्यवस्था है जो प्रोटीन के एक विविध पैनल में पाई जाती है, जिनमें से कुछ पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का कारण बनतीहैं 1. इंट्रा- या बाह्य अमाइलॉइड समुच्चय का संचय कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में मनाया जाता है2. अमाइलॉइड समुच्चय विषम होते हैं और बड़ी संख्या में प्रोटीन और लिपिड से समृद्ध होते हैं3. हाल के वर्षों में, एमिलॉयड प्रोटिओम में रुचि ने बुनियादी और ट्रांसलेशनल न्यूरोसाइंटिस्टों के बीच पर्याप्त रुचि पैदा की है। माउस और पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क के ऊतकों से अमाइलॉइड समुच्चय को निकालने और शुद्ध करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। अमाइलॉइड समुच्चय के लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन, इम्यूनोप्रेसिपिटेशन, डिसेल्युलराइजेशन और जैव रासायनिक अलगाव का व्यापक रूप से अमाइलॉइड सजीले टुकड़े, फाइब्रिल और ऑलिगोमर्स 4,5,6,7 को निकालने और शुद्ध करने के तरीकों का उपयोग किया जाता है। इनमें से कई अध्ययनों ने अर्ध-मात्रात्मक एमएस का उपयोग करके इन कसकर पैक फाइब्रिलर जमा की प्रोटीन संरचना का निर्धारण करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, उपलब्ध परिणाम असंगत हैं, और पहले रिपोर्ट किए गए सह-शुद्ध प्रोटीन की आश्चर्यजनक रूप से बड़ी संख्या व्याख्या करना चुनौतीपूर्ण है।
एडी और एडी माउस मॉडल दिमाग में अमाइलॉइड कोर प्रोटिओम का वर्णन करने वाले मौजूदा साहित्य की प्राथमिक सीमा यह है कि शुद्ध सामग्री में सह-शुद्ध प्रोटीन की एक असहनीय संख्या होती है। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य इस सीमा को दूर करना और अमाइलॉइड फाइब्रिल कोर को अलग करने के लिए एक मजबूत जैव रासायनिक शुद्धिकरण विकसित करना है। यह रणनीति पोस्टमार्टम एडी मानव और माउस मस्तिष्क के ऊतकों 8,9 से एसडीएस अघुलनशील समृद्ध अमाइलॉइड अंशों के अलगाव के लिए पहले से वर्णित सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित जैव रासायनिक विधि को नियोजित करती है। यह विधि मौजूदा साहित्य पर बनाती है लेकिन अल्ट्रासोनिकेशन और एसडीएस वॉश के साथ आगे बढ़ती है ताकि अधिकांश शिथिल बाध्य एमिलॉयड से जुड़े प्रोटीन को हटाया जा सके, जिससे अत्यधिक शुद्ध एमिलॉयड फाइब्रिल (चित्रा 1) का अलगाव होता है। इस प्रोटोकॉल द्वारा शुद्ध फाइब्रिल मस्तिष्क के अर्क से अलग अमाइलॉइड फाइब्रिल के संरचनात्मक अध्ययन में अक्सर सामना की जाने वाली कई मौजूदा चुनौतियों को दूर करते हैं। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के साथ इन फाइब्रिल का विज़ुअलाइज़ेशन शुद्ध सामग्री (चित्रा 2) की अखंडता और शुद्धता की पुष्टि करता है। इस अध्ययन में, पृथक फाइब्रिल घुलनशील होते हैं और ट्रिप्सिन के साथ पेप्टाइड्स को पचाते हैं, और लेबल मुक्त एमएस विश्लेषण आसानी से फाइब्रिल कोर बनाने वाले प्रोटीन की पहचान को प्रकट कर सकता है। विशेष रूप से, इनमें से कुछ प्रोटीनों में गैर-झिल्ली-बाध्य ऑर्गेनेल में सुपरमॉलिक्युलर असेंबली बनाने की अंतर्निहित प्रवृत्ति होती है। इसके अलावा, अमाइलॉइड-बीटा (एβ) फाइब्रिल के विश्लेषण में पहचाने जाने वाले कई प्रोटीन अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से भी जुड़े हुए हैं, यह सुझाव देते हुए कि ये प्रोटीन कई प्रोटीनोपैथी में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।
अल्ट्रासोनिकेशन विधि फाइब्रिल कोर की संरचना को बदलने या बाधित करने की संभावना नहीं है। शुद्ध सामग्री टॉप-डाउन और बॉटम-अप प्रोटिओमिक विश्लेषण दृष्टिकोण और अतिरिक्त एमएस-आधारित संरचनात्मक विश्लेषण रणनीतियों, जैसे रासायनिक क्रॉसलिंकिंग या हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए भी उपयुक्त है। इस पद्धति का उपयोग करके समग्र वसूली अपेक्षाकृत अधिक है और इस प्रकार, विस्तृत संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त है, जिसके लिए शुद्ध सामग्री के मिलीग्राम के लिए माइक्रोग्राम की आवश्यकता होती है। शुद्ध सामग्री क्रायोईएम और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संरचनात्मक अध्ययन के लिए भी उपयुक्त है। स्तनधारियों के स्थिर आइसोटोपिक लेबलिंग के साथ संयोजन में यह प्रोटोकॉल, अमाइलॉइड संरचना10 के ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमिलॉयड संरचना और संरचना की स्पष्ट समझ विकसित करना संरचनात्मक जीवविज्ञानियों और बायोकेमिस्टों के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि जैविक जटिलताओं और एडी मस्तिष्क के ऊतकों16,17 से शुद्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान आर 01 एजी 061865 द्वारा आरजेवी और जेएनएस को समर्थित किया गया था। लेखकों ने नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी में वासर और सावास अनुसंधान समूह के सदस्यों को उनकी विचारशील चर्चाओं के लिए धन्यवाद दिया। हम डॉ (ओं) को भी ईमानदारी से धन्यवाद देते हैं। अंसगर सीमर और राल्फ लैंगेन पर दक्षिण कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय उनके महत्वपूर्ण इनपुट के लिए। हम नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी में नमूना तैयार करने और नकारात्मक धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए डॉ फरीदा कोराबोवा को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
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