Denne biokjemiske rensemetoden med massespektrometribasert proteomisk analyse letter den robuste karakteriseringen av amyloidfibrilkjerner, noe som kan akselerere identifiseringen av mål for å forhindre Alzheimers sykdom.
Proteinholdige fibrillar inneslutninger er viktige patologiske kjennetegn på flere nevrodegenerative sykdommer. I de tidlige stadiene av Alzheimers sykdom (AD) danner amyloid-beta peptider protofibrils i det ekstracellulære rommet, som fungerer som frø som gradvis vokser og modnes til store amyloidplakk. Til tross for denne grunnleggende forståelsen er dagens kunnskap om amyloidfibrilstrukturen, sammensetningen og avsetningsmønstrene i hjernen begrenset. En stor barriere har vært manglende evne til å isolere svært rensede amyloidfibriler fra hjerneekstrakter. Affinitetsrensing og laserfangst mikrodeseksjonsbaserte tilnærminger har tidligere blitt brukt til å isolere amyloider, men er begrenset av den lille mengden materiale som kan gjenvinnes. Denne nye, robuste protokollen beskriver biokjemisk rensing av amyloid plakkkjerner ved hjelp av natrium dodecylsulfat (SDS) solubilisering med sukrose tetthet gradient ultracentrifugation og ultralydbehandling og gir svært rene fibrils fra AD pasienter og AD modell hjernevev. Massespektrometri (MS)-basert bunn-opp proteomisk analyse av det rensede materialet representerer en robust strategi for å identifisere nesten alle de primære proteinkomponentene i amyloidfibriler. Tidligere proteomiske studier av proteiner i amyloid korona har avslørt en uventet stor og funksjonelt mangfoldig samling av proteiner. Spesielt, etter å ha raffinert rensestrategien, ble antall korensende proteiner redusert med mer enn 10 ganger, noe som indikerer den høye renheten til det isolerte SDS-uoppløselige materialet. Negativ farging og immuno-gull elektronmikroskopi tillot bekreftelse på renheten til disse preparatene. Videre studier er nødvendig for å forstå de romlige og biologiske egenskapene som bidrar til avsetning av disse proteinene til amyloid inneslutninger. Samlet sett er denne analytiske strategien godt posisjonert for å øke forståelsen av amyloidbiologi.
Amyloid er et ekstremt stabilt supramolecular arrangement som finnes i et mangfoldig panel av proteiner, hvorav noen fører til patologiske endringer1. Akkumuleringen av intra- eller ekstracellulære amyloidaggregater observeres i flere nevrodegenerative sykdommer2. Amyloid aggregater er heterogene og er beriket med et stort antall proteiner og lipider3. De siste årene har interessen for amyloidproteom generert betydelig interesse blant grunnleggende og translasjonelle nevrologer. Flere metoder er utviklet for å trekke ut og rense amyloidaggregater fra mus og post-mortem humant hjernevev. Laserfangst mikrodeseksjon, immunoprecipitation, decellularisering og biokjemisk isolasjon av amyloidmengder er mye brukt metoder for å trekke ut og rense amyloidplakk, fibrils og oligomerer 4,5,6,7. Mange av disse studiene har fokusert på å bestemme proteinsammensetningen av disse tettpakkede fibrillaravsetningene ved hjelp av semi-kvantitativ MS. De tilgjengelige resultatene er imidlertid inkonsekvente, og det overraskende store antallet co-rensende proteiner som tidligere er rapportert, er utfordrende å tolke.
Den primære begrensningen i den eksisterende litteraturen som beskriver amyloidkjerneproteomet i AD- og AD-musemodellhjerner, er at det rensede materialet inneholder et uhåndterlig antall korensende proteiner. Det overordnede målet med denne metoden er å overvinne denne begrensningen og utvikle en robust biokjemisk rensing for å isolere amyloidfibrilkjerner. Denne strategien benytter en tidligere beskrevet sukrose tetthet gradient ultracentrifugation-basert biokjemisk metode for isolering av SDS uoppløselige beriket amyloid fraksjoner fra post-mortem AD human og mus hjernevev 8,9. Denne metoden bygger på den eksisterende litteraturen, men går videre med ultralydbehandling og SDS-vasker for å fjerne de fleste løst bundne amyloid-tilknyttede proteiner, noe som fører til isolering av svært rensede amyloidfibriler (figur 1). Fibrils renset av denne protokollen overvinne flere eksisterende utfordringer ofte møtt i strukturelle studier av amyloid fibrils isolert fra hjernen ekstrakter. Visualisering av disse fibrilene med transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bekrefter integriteten og renheten til det rensede materialet (figur 2). I denne studien blir de isolerte fibrilene solubilisert og fordøyd til peptider med trypsin, og etikettfri MS-analyse kan lett avsløre identiteten til proteinene som danner fibrilkjernen. Spesielt har noen av disse proteinene en iboende tendens til å danne supramolekulære forsamlinger i ikke-membranbundne organeller. I tillegg er mange av proteinene identifisert i analysen av amyloid-beta (Aβ) fibrils også forbundet med andre nevrodegenerative sykdommer, noe som tyder på at disse proteinene kan spille en nøkkelrolle i flere proteinopatier.
Denne SDS / ultralydbehandlingsmetoden er usannsynlig å endre eller forstyrre strukturen til fibrilkjernene. Det rensede materialet er også egnet for et bredt spekter av ovenfra og ned og nedenfra-og-opp proteomiske analysetilnærminger og ytterligere MS-baserte strukturelle analysestrategier, for eksempel kjemisk krysskobling eller hydrogen-deuteriumutveksling. Den totale utvinningen ved hjelp av denne metoden er relativt høy og er derfor egnet for detaljerte strukturelle studier, som krever mikrogram til milligram av det rensede materialet. Det rensede materialet er også egnet for strukturelle studier ved hjelp av kryoEM og atomkraftmikroskopi. Denne protokollen, i kombinasjon med stabil isotopisk merking av pattedyr, kan lette solid-state kjernemagnetisk resonans (NMR) studier av amyloid struktur10.
Å utvikle en klar forståelse av amyloidstruktur og sammensetning er utfordrende for strukturbiologer og biokjemikere på grunn av de biologiske kompleksitetene og eksperimentelle begrensningene ved å trekke ut rensede fibriler fra AD-hjernevev16,17. Amyloid fibrils er polymorfiske på molekylært nivå, og viser en heterogen befolkning av varierende lengder og kompleksiteter18,19. For bedre å forstå …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH grant R01AG061865 til R.J.V. og J.N.S. Forfatterne takker Vassar og Savas forskningsgruppemedlemmer ved Northwestern University for deres gjennomtenkte diskusjoner. Vi takker også oppriktig Dr(s). Ansgar Seimer og Ralf Langen ved University of South California for deres avgjørende innspill. Vi takker Dr. Farida Korabova for prøvepreparering og negativ farging elektronmikroskopiavbildning ved Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |