Summary

Выделение преадипоцитов из эмбрионов цыплят-бройлеров

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

Настоящий протокол описывает простой способ выделения преадипоцитов из жировой ткани у эмбрионов бройлеров. Этот метод позволяет выделить с высоким выходом, первичной культурой и адипогенной дифференцировкой преадипоцитов. Окрашивание маслом Red O и окрашивание липидов/ДНК измеряли адипогенную способность изолированных клеток, индуцированных дифференцировочными средами.

Abstract

Первичные преадипоциты являются ценной экспериментальной системой для понимания молекулярных путей, которые контролируют дифференцировку и метаболизм адипоцитов. Куриные эмбрионы дают возможность выделить преадипоциты с самой ранней стадии развития жировой ткани. Эта первичная клетка может быть использована для выявления факторов, влияющих на пролиферацию преадипоцитов и адипогенную дифференцировку, что делает их ценной моделью для исследований, связанных с детским ожирением и контролем избыточного отложения жира у домашней птицы. Быстрый рост постнатальной жировой ткани эффективно истощает корм, распределяя его вдали от роста мышц у цыплят-бройлеров. Таким образом, методы понимания самых ранних стадий развития жировой ткани могут дать подсказки для регулирования этой тенденции и определения способов ограничения расширения жировой ткани в раннем возрасте. Настоящее исследование было разработано для разработки эффективного метода выделения, первичной культуры и адипогенной дифференцировки преадипоцитов, выделенных из развивающейся жировой ткани коммерческих эмбрионов цыплят бройлеров (мясного типа). Процедура была оптимизирована для получения клеток с высокой жизнеспособностью (~ 98%) и повышенной способностью дифференцироваться в зрелые адипоциты. Этот простой метод выделения, культивирования и дифференцировки эмбриональных преадипоцитов поддерживает функциональный анализ роста и развития жиров в раннем возрасте.

Introduction

Ожирение является глобальной угрозой для здоровья как взрослых, так и детей. Дети с избыточным весом или ожирением примерно в пять раз чаще страдают ожирением во взрослом возрасте, что подвергает их значительно повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и многих других сопутствующих заболеваний. Около 13,4% американских детей в возрасте 2-5 лет имеют ожирение1, что свидетельствует о том, что тенденция накапливать избыток жира в организме может быть приведена в движение очень рано в жизни. По самым разным причинам накопление избыточной жировой ткани является проблемой для цыплят-бройлеров (мясного типа). Современные бройлеры невероятно эффективны, но все же накапливают больше липидов, чем физиологически необходимо 2,3. Эта тенденция начинается вскоре после вылупления и эффективно растрачивает корм, самый дорогой производственный компонент, выделяя его вдали от роста мышц. Поэтому как для детей, так и для цыплят-бройлеров, хотя и по самым разным причинам, необходимо понимать факторы, влияющие на развитие жировой ткани, и определять способы ограничения жирового расширения в раннем возрасте.

Адипоциты образуются из преадипоцитов, стволовых клеток, полученных из жировой ткани, которые подвергаются дифференцировке для развития зрелых, накапливающих липиды жировых клеток. Соответственно, преадипоциты in vitro являются ценной экспериментальной моделью для исследований ожирения. Эти клетки, выделенные из стромальной сосудистой фракции жировых депо, могут обеспечить фундаментальное понимание молекулярных путей, контролирующих дифференцировку и метаболизм адипоцитов 4,5. Эмбрионы цыплят являются благоприятной экспериментальной моделью в исследованиях развития, потому что культивирование яиц по желаемому графику облегчает экспериментальные манипуляции, поскольку позволяет получить эмбрионы без жертв матери для наблюдения за серией стадий развития эмбрионов. Кроме того, для получения эмбрионов по сравнению с более крупными моделями животных не требуются сложные хирургические процедуры и длительные периоды времени. Поэтому эмбрион цыпленка представляет возможность получения преадипоцитов с самых ранних стадий развития жировой ткани. Подкожная жировая клетчатка становится видимой у птенца около эмбрионального дня 12 (Е12) в виде четко очерченного депо, расположенного вокруг бедра. Это депо обогащено высокопролиферативными преадипоцитами, которые активно подвергаются дифференцировке под сигналами развития с образованием зрелых адипоцитов 6,7. Процесс адипогенной дифференциации сопоставим между курами и человеком. Поэтому преадипоциты, выделенные из эмбрионов цыплят, могут быть использованы в качестве модели двойного назначения для исследований, имеющих отношение к людям и домашней птице. Однако выход преадипоцитов снижается со старением, поскольку клетки вырастают в зрелые адипоциты5.

Настоящий протокол оптимизирует выделение преадипоцитов из жировой ткани на стадии (E16-E18), на которой адипогенная дифференцировка и гипертрофия адипоцитов находятся на пике у эмбрионов цыплят бройлеров8. Эта процедура может оценить влияние факторов, которым развивается эмбрион в ово, таких как диета курицы, на развитие адипоцитов и адипогенный потенциал ex vivo. Он также может проверить влияние различных манипуляций (например, гипоксии, питательных добавок, фармакологических агонистов и антагонистов) на адипогенез или различные «омы» (например, транскриптом, метаболом, метилом) предшественников адипоцитов. Как представление самой ранней стадии образования жиров, клетки, полученные с использованием этого протокола, являются ценными моделями для исследований, относящихся к домашней птице и человеку.

Protocol

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Теннесси. Свежеоплодотворенные коммерческие яйца бройлеров (Cobb 500) были получены из местного инкубатория. Яйца инкубировали при 38 °C с относительной влажностью 60% до р?…

Representative Results

Первичные преадипоциты морфологически похожи на фибробласты, с неправильными, звездообразными формами и центральным ядром (рисунок 2A-C). Клетки легко прилипают к пластике тканевой культуры и начинают размножаться вскоре после прикрепления. Они быстр?…

Discussion

Хотя в нескольких хорошо описанных протоколах сообщалось об выделении преадипоцитов 14,15,16,17, изоляция для эмбриональных преадипоцитов была оптимизирована, что может быть использовано для функционального анализа роста и развития жира в раннем возрасте у цыплят брой?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят UT AgResearch и Департамент наук о животных за поддержку и оптимизацию этого протокола. Эта работа финансировалась за счет гранта Министерства сельского хозяйства США.

Materials

1 mL Pipette Eppendorf Z683825 Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL
1 mL Pipette Tip Fisher Scientific 02-707-402
100% Isopropanol Fisher Scientific A426P4
1x PBS Gibco 10010023
25 mL Flask Pyrex 4980-25
37% Formaldehyde Fisher Scientific F75P-1GAL
6-Well Plate Falcon 353046 Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate Costar 3632
96-Well Plate, Black Bottom Costar 3603 Tissue Culture-treated
AdipoRed Lonza PT-7009
Amphotericin B Gibco 15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper) Kimberly-Clark 34155
Betadine Up & Up NDC 1167300334 20% Working Solution
Cell Counter Corning 6749
Cell Strainer, 40 µm SPL 93040
Centrifugaton Eppendorf 5702
Chicken Serum Gibco 16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL VWR 10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL Falcon 352098
Cryovial Nunc 343958
Curved Forceps, 100 mm Roboz Surgical RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm Roboz Surgical RS-6839
Distilled Water Millipore SYNSV0000 Despensed as needed
DMEM/F12 HyClone SH30023.01
DMSO Sigma D2650
Ethanol Decon Labs 2701 70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
Fluorescent Microscope Evos M7000
Fluorescent Plate Reader Biotek Synergy H1
Foil Reynolds Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
Gelatin Millipore 4055 2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber) Corning 480200 0.1 mm deep
Incubator Fisher Scientific 6845
Instrument Sterilizer VWR B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin Sigma L9655 1x Working Solution
Microscope Evos AMEX1000
Multi-Channel Pipette Thermo Scientific 4661070 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL
Na2HPO4 Sigma S-7907
NaH2PO4 Sigma S-3139
NucBlue Invitrogen R37605
Oil Red O Sigma O-0625
Orbital Shaker IKA KS130BS1
Paper Towel Tork RK8002
Parafilm Parafilm M PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S) Gibco 15140122 1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm Falcon 351029
Petri dishes, 60 mm Falcon 351007
Plate Shaker VWR 200
RBC Lysis Buffer Roche 11814389001
Reagent Reservior VWR 89094-680
Small Beaker, 100 mL Pyrex 1000-100
Spectrophotometer Plate Reader Biotek Synergy H1
Sterile Gauze McKesson 762703
Straight Forceps, 120 mm Roboz Surgical RS-4960
Straight Scissors, 140 mm Roboz Surgical RS-6762
T-25 Flask Corning 430639 Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific 50144906
Tissue Strainer, 250 µm Pierce 87791
Trypan Blue Stain Gibco 15250061
Trypsin Gibco 15400054 0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm Roboz Surgical RS-5035
Type 1 Collagenase Gibco 17100017
Water Bath Fisher Scientific 15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-110

References

  1. Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
  2. Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
  3. Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
  4. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  5. Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
  6. Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
  7. Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
  8. Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
  9. Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
  10. . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
  11. Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
  12. Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
  13. Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
  15. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
  16. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
  18. Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
  19. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
  20. Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
  21. Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kim, M., Jung, U., Shepherd, E., Mihelic, R., Voy, B. H. Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos. J. Vis. Exp. (186), e63861, doi:10.3791/63861 (2022).

View Video