عزل الخلايا البدائية عن أجنة الدجاج اللاحم
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية من الأنسجة الدهنية في أجنة اللاحم. تتيح هذه الطريقة العزل مع غلة عالية ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي للخلايا الدهنية. قام تلطيخ الزيت الأحمر O وبقع الدهون / الحمض النووي بقياس القدرة الشحمية للخلايا المعزولة المستحثة بوسائط التمايز.
Abstract
الخلايا الشحمية الأولية هي نظام تجريبي قيم لفهم المسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي. توفر أجنة الدجاج الفرصة لعزل الخلايا الشهية من المرحلة المبكرة من التطور الدهني. يمكن استخدام هذه الخلية الأولية لتحديد العوامل التي تؤثر على انتشار الخلايا ما قبل الشحمية والتمايز الشحمي المنشأ ، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات المتعلقة بالسمنة في مرحلة الطفولة والسيطرة على ترسب الدهون الزائدة في الدواجن. النمو السريع للأنسجة الدهنية بعد الولادة يهدر الأعلاف بشكل فعال عن طريق تخصيصها بعيدا عن نمو العضلات في الدجاج اللاحم. لذلك ، قد توفر طرق فهم المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية أدلة لتنظيم هذا الميل وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة. تم تصميم هذه الدراسة لتطوير طريقة فعالة للعزل ، والثقافة الأولية ، والتمايز الشحمي المنشأ للخلايا الشهية المعزولة عن تطوير الأنسجة الدهنية لأجنة الدجاج اللاحم التجاري (نوع اللحوم). تم تحسين الإجراء لإنتاج خلايا ذات صلاحية عالية (~ 98٪) وزيادة القدرة على التمايز إلى خلايا دهنية ناضجة. تدعم هذه الطريقة البسيطة لعزل الخلايا المعقدة، وثقافتها، وتمايزها التحليلات الوظيفية لنمو الدهون وتطورها في الحياة المبكرة.
Introduction
السمنة هي تهديد صحي عالمي لكل من البالغين والأطفال. الأطفال الذين يعانون من زيادة الوزن أو السمنة هم أكثر عرضة بخمس مرات تقريبا للإصابة بالسمنة مثل البالغين ، مما يعرضهم لخطر متزايد بشكل كبير للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والعديد من الأمراض المصاحبة الأخرى. حوالي 13.4٪ من الأطفال الأمريكيين الذين تتراوح أعمارهم بين 2-5 يعانون من السمنة1 ، مما يدل على أن الميل إلى تراكم الدهون الزائدة في الجسم يمكن أن يبدأ في وقت مبكر جدا من الحياة. لأسباب مختلفة جدا ، فإن تراكم الأنسجة الدهنية الزائدة هو مصدر قلق للدجاج اللاحم (نوع اللحوم). اللاحم الحديث فعال بشكل لا يصدق ولكن لا يزال يتراكم المزيد من الدهون مما هو ضروري من الناحية الفسيولوجية 2,3. يبدأ هذا الاتجاه بعد فترة وجيزة من الفقس ويهدر الأعلاف بشكل فعال ، وهو أغلى مكون إنتاج ، عن طريق تخصيصه بعيدا عن نمو العضلات. لذلك ، بالنسبة لكل من الأطفال والدجاج اللاحم ، وإن كان ذلك لأسباب مختلفة للغاية ، هناك حاجة لفهم العوامل التي تؤثر على نمو الأنسجة الدهنية وتحديد طرق للحد من توسع الدهون في وقت مبكر من الحياة.
تتشكل الخلايا الشحمية من الخلايا الدهنية ، وهي خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية تخضع للتمايز لتطوير خلايا دهنية ناضجة تخزن الدهون. وفقا لذلك ، فإن الخلايا البدائية في المختبر هي نموذج تجريبي قيم لدراسات السمنة. هذه الخلايا ، المعزولة عن الجزء الوعائي اللحمية من المستودعات الدهنية ، يمكن أن توفر فهما أساسيا للمسارات الجزيئية التي تتحكم في تمايز الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائي 4,5. تعتبر أجنة الكتاكيت نموذجا تجريبيا مواتيا في الدراسات التنموية لأن زراعة البيض وفقا للجدول الزمني المطلوب يجعل التلاعب التجريبي أسهل ، لأنه يتيح الحصول على الأجنة دون تضحية الأم لمراقبة سلسلة من مراحل نمو الأجنة. علاوة على ذلك ، لا يلزم إجراء عمليات جراحية معقدة وفترات زمنية طويلة للحصول على الأجنة مقارنة بالنماذج الحيوانية الأكبر. لذلك ، يقدم جنين الفرخ فرصة للحصول على الخلايا الدهنية من المراحل المبكرة من تطور الأنسجة الدهنية. تصبح الأنسجة الدهنية تحت الجلد مرئية في الفرخ حول اليوم الجنيني 12 (E12) كمستودع محدد بوضوح يقع حول الفخذ. يتم إثراء هذا المستودع في الخلايا الشحمية عالية التكاثر التي تخضع بنشاط للتمايز تحت إشارات تنموية لتشكيل الخلايا الشحمية الناضجة 6,7. عملية التمايز الشحمي قابلة للمقارنة بين الدجاج والبشر. لذلك ، يمكن استخدام الخلايا البدائية المعزولة من أجنة الكتاكيت كنموذج مزدوج الغرض للدراسات ذات الصلة بالبشر والدواجن. ومع ذلك ، فإن غلة الخلايا الدهنية الأولية تنخفض مع الشيخوخة حيث تنمو الخلايا إلى الخلايا الشحمية الناضجة5.
يعمل البروتوكول الحالي على تحسين عزل الخلايا الدهنية عن الأنسجة الدهنية خلال المرحلة (E16-E18) التي يكون فيها التمايز الشحمي المنشأ وتضخم الخلايا الشحمية في ذروتهما في أجنة الفرخ اللاحم8. يمكن لهذا الإجراء تقييم آثار العوامل التي يتعرض لها الجنين النامي في البيضاوة ، مثل النظام الغذائي للدجاجة ، على تطور الخلايا الشحمية والإمكانات الشحمية خارج الجسم الحي. ويمكنه أيضا اختبار تأثير التلاعب المختلفة (على سبيل المثال ، نقص الأكسجة ، وإضافات المغذيات ، والناهضات الدوائية ، والخصوم) على تكوين الدهون أو مختلف ‘omes’ (على سبيل المثال ، transcriptome ، metabolome ، methylome) من أسلاف الخلايا الشحمية. كتمثيل للمرحلة المبكرة من تكوين الدهون ، تعد الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول نماذج قيمة للدراسات ذات الصلة بالدواجن والبشر.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن العديد من البروتوكولات الموصوفة جيدا قد أبلغت عن عزل الخلايا الشهية14،15،16،17 ، فقد تم تحسين عزل الخلايا الشهية الجنينية ، والتي يمكن استخدامها للتحليلات الوظيفية لنمو الدهون في وقت مبكر من الحياة وتطورها في فر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون UT AgResearch وقسم علوم الحيوان على دعم وتحسين هذا البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة وزارة الزراعة الأمريكية.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
