ブロイラーチック胚からの前駆脂肪細胞の単離
Summary
本プロトコールは、ブロイラー胚における脂肪組織から前駆脂肪細胞を単離するための簡単な方法を記載する。この方法は、高収率での単離、初代培養、および前駆脂肪細胞の脂肪生成分化を可能にする。オイルレッドO染色および脂質/DNA染色は、分化培地で誘導された単離細胞の脂肪生成能力を測定しました。
Abstract
初代前駆脂肪細胞は、脂肪細胞の分化と代謝を制御する分子経路を理解するための貴重な実験系です。ニワトリ胚は、脂肪発生の初期段階から前駆脂肪細胞を単離する機会を提供する。この初代細胞は、前駆脂肪細胞の増殖および脂肪生成分化に影響を及ぼす因子を同定するために使用することができ、小児肥満および家禽における過剰な脂肪沈着の制御に関連する研究のための貴重なモデルとなる。出生後の脂肪組織の急速な成長は、ブロイラー鶏の筋肉成長から離れてそれを割り当てることによって効果的に飼料を無駄にします。したがって、脂肪組織発達の初期段階を理解する方法は、この傾向を調節し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する手がかりを提供する可能性がある。本研究は、市販のブロイラー(肉型)ニワトリ胚の発生脂肪組織から単離された前駆脂肪細胞の単離、初代培養、および脂肪生成分化のための効率的な方法を開発するために設計された。この手順は、高い生存率(〜98%)および成熟脂肪細胞への分化能力の増加を有する細胞を産生するように最適化されている。胚性前駆脂肪細胞の単離、培養、および分化のこの簡単な方法は、早期の脂肪の成長と発達の機能解析をサポートします。
Introduction
肥満は、成人と子供の両方にとって世界的な健康上の脅威です。太りすぎまたは肥満の子供は、成人として肥満になる可能性が約5倍高く、心血管疾患、糖尿病、および他の多くの併存疾患のリスクが著しく高くなります。2〜5歳の米国の子供の約13.4%が肥満1を有しており、過剰な体脂肪を蓄積する傾向が人生の非常に早い段階で動き出すことができることを示している。非常に異なる理由から、過剰な脂肪組織の蓄積はブロイラー(肉型)鶏にとって懸念事項です。現代のブロイラーは信じられないほど効率的ですが、生理学的に必要であるよりも多くの脂質を蓄積します2,3。この傾向は孵化直後に始まり、筋肉の成長から離れて割り当てることによって、最も高価な生産成分である飼料を効果的に無駄にします。したがって、子供とブロイラー鶏の両方にとって、非常に異なる理由にもかかわらず、脂肪組織の発達に影響を与える要因を理解し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する必要があります。
脂肪細胞は、前駆脂肪細胞から形成され、成熟した脂質貯蔵脂肪細胞を発達させるために分化を受ける脂肪組織由来幹細胞である。したがって、インビトロでの脂肪前駆細胞は、肥満研究のための貴重な実験モデルである。これらの細胞は、脂肪デポーの間質血管画分から単離され、脂肪細胞の分化および代謝を制御する分子経路の基本的な理解を提供することができる4、5。ひよこ胚は、卵を所望のスケジュールで培養すると、母親の犠牲を払わずに胚を取得して胚の一連の発生段階を観察できるため、実験操作が容易になるため、発生研究において好ましい実験モデルである。さらに、より大規模な動物モデルと比較して胚を得るために、複雑な外科的処置および長い期間を必要としない。したがって、ひよこ胚は、脂肪組織発達の初期段階から前駆脂肪細胞を得る機会を提供する。皮下脂肪組織は、胚期12日目(E12)の周りのひよこにおいて、大腿部の周囲に位置する明確に定義されたデポーとして見えるようになる。このデポーは、成熟脂肪細胞を形成するための発達の手がかりの下で積極的に分化を受ける高度に増殖性前駆脂肪細胞に富んでいる6,7。脂肪生成分化のプロセスは、ニワトリとヒトの間で同等である。したがって、ひよこ胚から単離された前駆脂肪細胞は、ヒトおよび家禽に関連する研究のための二重目的モデルとして使用することができる。しかし、前駆脂肪細胞の収量は、細胞が成熟脂肪細胞に成長するにつれて加齢とともに低下する5。
本プロトコールは、ブロイラーニワトリ胚において脂肪生成分化および脂肪細胞肥大がピークとなる段階(E16−E18)における脂肪組織からの前駆脂肪細胞の単離を最適化する8。この手順は、鶏の食事療法などの ovoにおいて発達中の胚が曝露される因子が脂肪細胞の発生および エキソビボでの脂肪生成可能性に及ぼす影響を評価することができる。また、脂肪形成に対する様々な操作(例えば、低酸素、栄養素添加、薬理学的アゴニスト、およびアンタゴニスト)または脂肪細胞前駆細胞の様々な’omes(例えば、トランスクリプトーム、メタボローム、メチローム)への影響を試験することもできる。脂肪形成の初期段階の表現として、このプロトコルを使用して得られた細胞は、家禽およびヒトに関連する研究のための貴重なモデルである。
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかのよく記載されたプロトコールが前駆脂肪細胞14、15、16、17の単離を報告しているが、胚性前駆脂肪細胞に対する単離は最適化されており、これはブロイラーひよこの初期脂肪の成長および発達の機能分析に使用することができる。このプロトコールは、高い分化能を有する高い生存率?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、このプロトコルを支援し最適化してくれたUT AgResearchと動物科学科に感謝する。この作業はUSDAの助成金によって資金提供されました。
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
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