Isolatie van preadipocyten uit vleeskuikenembryo's
Summary
Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het isoleren van preadipocyten uit vetweefsel in vleeskuikenembryo’s. Deze methode maakt isolatie mogelijk met een hoge opbrengst, primaire cultuur en adipogene differentiatie van preadipocyten. Olie Rode O-kleuring en lipide/ DNA-kleuring maten het adipogene vermogen van geïsoleerde cellen geïnduceerd met differentiatiemedia.
Abstract
Primaire preadipocyten zijn een waardevol experimenteel systeem voor het begrijpen van de moleculaire routes die de differentiatie en het metabolisme van adipocyten regelen. Kippenembryo’s bieden de mogelijkheid om preadipocyten te isoleren vanaf het vroegste stadium van de ontwikkeling van vetstoffen. Deze primaire cel kan worden gebruikt om factoren te identificeren die de proliferatie van preadipocyten en adipogene differentiatie beïnvloeden, waardoor ze een waardevol model zijn voor studies met betrekking tot obesitas bij kinderen en de controle van overtollige vetafzetting bij pluimvee. De snelle groei van postnatale vetweefsel verspilt effectief voer door het weg te trekken van spiergroei bij vleeskuikens. Daarom kunnen methoden om de vroegste stadia van de ontwikkeling van vetweefsel te begrijpen aanwijzingen geven om deze neiging te reguleren en manieren te identificeren om vetexpansie vroeg in het leven te beperken. De huidige studie was ontworpen om een efficiënte methode te ontwikkelen voor isolatie, primaire cultuur en adipogene differentiatie van preadipocyten geïsoleerd uit het ontwikkelen van vetweefsel van commerciële vleeskuiken (vleestype) kuikenembryo’s. De procedure is geoptimaliseerd om cellen op te leveren met een hoge levensvatbaarheid (~ 98%) en een verhoogd vermogen om te differentiëren tot volwassen adipocyten. Deze eenvoudige methode van embryonale preadipocytenisolatie, -cultuur en -differentiatie ondersteunt functionele analyses van vetgroei en -ontwikkeling in het vroege leven.
Introduction
Obesitas is een wereldwijde bedreiging voor de gezondheid van zowel volwassenen als kinderen. Kinderen met overgewicht of obesitas hebben ongeveer vijf keer meer kans om zwaarlijvig te zijn als volwassenen, waardoor ze een aanzienlijk verhoogd risico lopen op hart- en vaatziekten, diabetes en vele andere comorbiditeiten. Ongeveer 13,4% van de Amerikaanse kinderen van 2-5 jaar heeft obesitas1, wat illustreert dat de neiging om overtollig lichaamsvet te accumuleren al heel vroeg in het leven in gang kan worden gezet. Om heel verschillende redenen is de ophoping van overtollig vetweefsel een zorg voor vleeskuikens (vleesachtige) kippen. Moderne slachtkuikens zijn ongelooflijk efficiënt, maar accumuleren nog steeds meer lipiden dan fysiologisch noodzakelijk is 2,3. Deze neiging begint kort na het uitkomen en verspilt effectief voer, de duurste productiecomponent, door het weg te trekken van spiergroei. Daarom is het voor zowel kinderen als vleeskuikens, zij het om heel verschillende redenen, nodig om factoren te begrijpen die de ontwikkeling van vetweefsel beïnvloeden en manieren te vinden om vetexpansie vroeg in het leven te beperken.
Adipocyten vormen zich uit preadipocyten, van vetweefsel afgeleide stamcellen die differentiatie ondergaan om volwassen, lipide-opslaande vetcellen te ontwikkelen. Dienovereenkomstig zijn preadipocyten in vitro een waardevol experimenteel model voor obesitasstudies. Deze cellen, geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van vetdepots, kunnen een fundamenteel begrip bieden van moleculaire routes die de differentiatie van adipocyten en het metabolisme regelen 4,5. Kuikenembryo’s zijn een gunstig experimenteel model in ontwikkelingsstudies omdat het kweken van eieren volgens het gewenste schema experimentele manipulatie gemakkelijker maakt, omdat het het verkrijgen van embryo’s mogelijk maakt zonder het offer van de moeder om een reeks ontwikkelingsstadia van embryo’s te observeren. Bovendien zijn gecompliceerde chirurgische procedures en lange perioden niet nodig om embryo’s te verkrijgen ten opzichte van grotere diermodellen. Daarom biedt het kuikenembryo een kans om preadipocyten te verkrijgen uit de vroegste stadia van de ontwikkeling van vetweefsel. Onderhuids vetweefsel wordt zichtbaar in het kuiken rond embryonale dag 12 (E12) als een duidelijk gedefinieerd depot rond de dij. Dit depot is verrijkt met zeer proliferatieve preadipocyten die actief differentiatie ondergaan onder ontwikkelingssignalen om volwassen adipocyten te vormen 6,7. Het proces van adipogene differentiatie is vergelijkbaar tussen kippen en mensen. Daarom kunnen preadipocyten geïsoleerd uit kuikenembryo’s worden gebruikt als een model met twee doelen voor studies die relevant zijn voor mens en pluimvee. De opbrengst van preadipocyten neemt echter af met veroudering naarmate cellen uitgroeien tot volwassen adipocyten5.
Het huidige protocol optimaliseert de isolatie van preadipocyten uit vetweefsel tijdens het stadium (E16-E18) waarin adipogene differentiatie en adipocytenhypertrofie op hun hoogtepunt zijn in vleeskuikenembryo’s8. Deze procedure kan de effecten beoordelen van factoren waaraan het zich ontwikkelende embryo in ovo wordt blootgesteld, zoals het kippendieet, op de ontwikkeling van adipocyten en adipogene potentie ex vivo. Het kan ook de impact testen van verschillende manipulaties (bijv. Hypoxie, toevoegingen van voedingsstoffen, farmacologische agonisten en antagonisten) op adipogenese of de verschillende ‘omes(bijv. Transcriptoom, metaboloom, methyloom) van adipocytenvoorlopers. Als een weergave van het vroegste stadium van vetvorming, zijn cellen verkregen met behulp van dit protocol waardevolle modellen voor studies die relevant zijn voor pluimvee en mensen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel verschillende goed beschreven protocollen de isolatie van preadipocyten 14,15,16,17 hebben gemeld, is isolatie voor embryonale preadipocyten geoptimaliseerd, wat kan worden gebruikt voor functionele analyses van de vroege groei en ontwikkeling van vetgroei en ontwikkeling bij vleeskuikens. Dit protocol levert embryonale adipocytenvoorlopers met een hoge levensvatbaarheid op met een hoog …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken UT AgResearch en de afdeling Dierwetenschappen voor het ondersteunen en optimaliseren van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door USDA-subsidie.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
