Isolering af preadipocytter fra broilerkyllingembryoner
Summary
Denne protokol beskriver en simpel metode til isolering af præadipocytter fra fedtvæv i slagtekyllinger. Denne metode muliggør isolering med højt udbytte, primær kultur og adipogen differentiering af præadipocytter. Olie Rød O farvning og lipid / DNA-plet målte den adipogene evne af isolerede celler induceret med differentieringsmedier.
Abstract
Primære præadipocytter er et værdifuldt eksperimentelt system til forståelse af de molekylære veje, der styrer adipocytdifferentiering og metabolisme. Kyllingembryoner giver mulighed for at isolere præadipocytter fra det tidligste stadium af fedtudvikling. Denne primære celle kan bruges til at identificere faktorer, der påvirker præadipocytproliferation og adipogen differentiering, hvilket gør dem til en værdifuld model for undersøgelser relateret til fedme hos børn og kontrol af overskydende fedtaflejring hos fjerkræ. Den hurtige vækst af postnatal fedtvæv spilder effektivt foder ved at allokere det væk fra muskelvækst hos slagtekyllinger. Derfor kan metoder til at forstå de tidligste stadier af fedtvævsudvikling give spor til at regulere denne tendens og identificere måder at begrænse fedtudvidelse tidligt i livet. Denne undersøgelse var designet til at udvikle en effektiv metode til isolering, primær dyrkning og adipogen differentiering af præadipocytter isoleret fra udvikling af fedtvæv af kommercielle slagtekyllinger (kødtype) kyllingeembryoner. Proceduren er optimeret til at give celler med høj levedygtighed (~ 98%) og øget kapacitet til at differentiere sig til modne adipocytter. Denne enkle metode til embryonal præadipocytisolering, kultur og differentiering understøtter funktionelle analyser af fedtvækst og udvikling tidligt i livet.
Introduction
Fedme er en global sundhedstrussel for både voksne og børn. Børn, der er overvægtige eller fede, er cirka fem gange mere tilbøjelige til at være overvægtige som voksne, hvilket placerer dem i signifikant øget risiko for hjerte-kar-sygdomme, diabetes og mange andre comorbiditeter. Omkring 13,4% af amerikanske børn i alderen 2-5 har fedme1, hvilket illustrerer, at tendensen til at akkumulere overskydende kropsfedt kan sættes i gang meget tidligt i livet. Af meget forskellige grunde er akkumuleringen af overskydende fedtvæv en bekymring for slagtekyllinger (kødtype). Moderne slagtekyllinger er utroligt effektive, men akkumulerer stadig mere lipid end det er fysiologisk nødvendigt 2,3. Denne tendens begynder kort efter luge og spilder effektivt foder, den dyreste produktionskomponent, ved at allokere det væk fra muskelvækst. Derfor er der for både børn og slagtekyllinger, omend af meget forskellige grunde, behov for at forstå faktorer, der påvirker fedtvævsudviklingen og identificere måder at begrænse fedtudvidelsen tidligt i livet.
Adipocytter dannes fra preadipocytter, fedtvævsafledte stamceller, der gennemgår differentiering for at udvikle modne, lipidlagrende fedtceller. Følgelig er præadipocytter in vitro en værdifuld eksperimentel model for fedmeundersøgelser. Disse celler, isoleret fra den stromale vaskulære fraktion af fedtdepoter, kan give en grundlæggende forståelse af molekylære veje, der styrer adipocytdifferentiering og metabolisme 4,5. Kyllingeembryoner er en gunstig eksperimentel model i udviklingsundersøgelser, fordi dyrkning af æg på den ønskede tidsplan gør eksperimentel manipulation lettere, da det gør det muligt at opnå embryoner uden moderens offer for at observere en række udviklingsstadier af embryoner. Desuden er komplicerede kirurgiske procedurer og lange perioder ikke nødvendige for at opnå embryoner i forhold til større dyremodeller. Derfor giver kyllingembryret mulighed for at opnå præadipocytter fra de tidligste stadier af fedtvævsudvikling. Subkutant fedtvæv bliver synligt i kyllingen omkring embryonal dag 12 (E12) som et klart defineret depot placeret omkring låret. Dette depot er beriget i stærkt proliferative præadipocytter, der aktivt gennemgår differentiering under udviklingssignaler for at danne modne adipocytter 6,7. Processen med adipogen differentiering er sammenlignelig mellem kyllinger og mennesker. Derfor kan præadipocytter isoleret fra kyllingeembryoner anvendes som en model med dobbelt formål til undersøgelser, der er relevante for mennesker og fjerkræ. Udbyttet af præadipocytter falder imidlertid med aldring, da celler vokser til modne adipocytter5.
Den nuværende protokol optimerer isoleringen af præadipocytter fra fedtvæv i det stadium (E16-E18), hvor adipogen differentiering og adipocythypertrofi er på deres højeste islagtekyllingermbryoner 8. Denne procedure kan vurdere virkningerne af faktorer, som det udviklende embryo udsættes for i ovo, såsom hønediet, på adipocytudvikling og adipogent potentiale ex vivo. Det kan også teste virkningen af forskellige manipulationer (f.eks. Hypoxi, næringsstoftilsætninger, farmakologiske agonister og antagonister) på adipogenese eller de forskellige ‘omes (f.eks. Transkriptom, metabolom, methylom) af adipocytprogenitorer. Som en repræsentation af det tidligste stadium af fedtdannelse er celler opnået ved anvendelse af denne protokol værdifulde modeller for undersøgelser, der er relevante for fjerkræ og mennesker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom flere velbeskrevne protokoller har rapporteret isolering af præadipocytter 14,15,16,17, er isolering for embryonale præadipocytter blevet optimeret, hvilket kan bruges til funktionelle analyser af fedtvækst og udvikling i det tidlige liv hos slagtekyllinger. Denne protokol giver embryonale adipocytprogenitter med høj levedygtighed med højt differentieringspotentiale. Desuden er den …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker UT AgResearch og Institut for Husdyrvidenskab for at støtte og optimere denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af USDA-tilskud.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
