Isolering av Preadipocytes fra Broiler Chick Embryos
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en enkel metode for å isolere preadipocytter fra fettvev i broiler embryoer. Denne metoden muliggjør isolasjon med høyt utbytte, primærkultur og adipogene differensiering av preadipocytter. Oljerød O-farging og lipid/DNA-flekk målte den adipogene evnen til isolerte celler indusert med differensieringsmedier.
Abstract
Primære preadipocytter er et verdifullt eksperimentelt system for å forstå de molekylære veiene som styrer adipocytdifferensiering og metabolisme. Kyllingembryoer gir muligheten til å isolere preadipocytter fra det tidligste stadiet av fettutvikling. Denne primære cellen kan brukes til å identifisere faktorer som påvirker preadipocyttproliferasjon og adipogene differensiering, noe som gjør dem til en verdifull modell for studier relatert til barndommen fedme og kontroll av overflødig fettavsetning i fjærfe. Den raske veksten av postnatal fettvev kaster effektivt bort fôr ved å tildele det bort fra muskelvekst hos kyllingekyllinger. Derfor kan metoder for å forstå de tidligste stadiene av fettvevsutvikling gi ledetråder for å regulere denne tendensen og identifisere måter å begrense fettutvidelse tidlig i livet. Den nåværende studien ble designet for å utvikle en effektiv metode for isolasjon, primærkultur og adipogene differensiering av preadipocytter isolert fra å utvikle fettvev av kommersielle broilere (kjøtttype) kyllingembryoer. Prosedyren er optimalisert for å gi celler med høy levedyktighet (~ 98%) og økt kapasitet til å skille seg ut i modne adipocytter. Denne enkle metoden for embryonal preadipocyttisolasjon, kultur og differensiering støtter funksjonelle analyser av fettvekst og utvikling tidlig i livet.
Introduction
Fedme er en global helsetrussel for både voksne og barn. Barn som er overvektige eller overvektige er omtrent fem ganger mer sannsynlig å være overvektige som voksne, noe som gir dem betydelig økt risiko for kardiovaskulær sykdom, diabetes og mange andre komorbiditeter. Omtrent 13,4% av amerikanske barn i alderen 2-5 har fedme1, noe som illustrerer at tendensen til å akkumulere overflødig kroppsfett kan settes i gang veldig tidlig i livet. Av svært forskjellige grunner er opphopning av overflødig fettvev en bekymring for broiler (kjøtttype) kyllinger. Moderne broilere er utrolig effektive, men akkumulerer fortsatt mer lipid enn det som er fysiologisk nødvendig 2,3. Denne tendensen begynner kort tid etter luke og kaster effektivt bort fôr, den dyreste produksjonskomponenten, ved å tildele den bort fra muskelvekst. Derfor, for både barn og kyllingekyllinger, om enn av svært forskjellige grunner, er det behov for å forstå faktorer som påvirker fettvevsutvikling og identifisere måter å begrense fettutvidelse tidlig i livet.
Adipocytter dannes fra preadipocytter, fettvevsavledede stamceller som gjennomgår differensiering for å utvikle modne, lipidlagring av fettceller. Følgelig er preadipocytter in vitro en verdifull eksperimentell modell for fedmestudier. Disse cellene, isolert fra den stromale vaskulære brøkdelen av fettdepoter, kan gi en grunnleggende forståelse av molekylære veier som kontrollerer adipocytdifferensiering og metabolisme 4,5. Chick embryoer er en gunstig eksperimentell modell i utviklingsstudier fordi dyrking av egg på ønsket tidsplan gjør eksperimentell manipulasjon enklere, da det gjør det mulig å skaffe embryoer uten mors offer for å observere en rekke utviklingsstadier av embryoer. Videre er det ikke nødvendig med kompliserte kirurgiske prosedyrer og lange tidsperioder for å oppnå embryoer i forhold til større dyremodeller. Derfor presenterer kyllingembryoen en mulighet til å oppnå preadipocytter fra de tidligste stadiene av fettvevsutvikling. Subkutant fettvev blir synlig hos kyllingen rundt embryonal dag 12 (E12) som et klart definert depot som ligger rundt låret. Dette depotet er beriket i svært proliferative preadipocytter som aktivt gjennomgår differensiering under utviklingssignaler for å danne modne adipocytter 6,7. Prosessen med adipogene differensiering er sammenlignbar mellom kyllinger og mennesker. Derfor kan preadipocytter isolert fra kyllingembryoer brukes som en dual-purpose modell for studier som er relevante for mennesker og fjærfe. Imidlertid avtar utbyttet av preadipocytter med aldring etter hvert som cellene vokser til modne adipocytter5.
Den nåværende protokollen optimaliserer isolasjonen av preadipocytter fra fettvev i løpet av scenen (E16-E18) der adipogene differensiering og adipocytthypertrofi er på topp i broiler chick embryoer8. Denne prosedyren kan vurdere effekten av faktorer som det utviklende embryoet er utsatt for i ovo, for eksempel hønediett, på adipocyttutvikling og adipogene potensielle ex vivo. Det kan også teste virkningen av ulike manipulasjoner (f.eks. hypoksi, næringstilsetninger, farmakologiske agonister og antagonister) på adipogenese eller de forskjellige ‘omes (f.eks. transkripsjonom, metabolom, metylom) av adipocyttgenitorer. Som en representasjon av det tidligste stadiet av fettdannelse, er celler oppnådd ved hjelp av denne protokollen verdifulle modeller for studier som er relevante for fjærfe og mennesker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om flere godt beskrevne protokoller har rapportert isolering av preadipocytter 14,15,16,17, isolasjon for embryonale preadipocytter har blitt optimalisert, som kan brukes til funksjonelle analyser av tidlig liv fett vekst og utvikling i broiler kyllinger. Denne protokollen gir høy levedyktighet embryonale adipocytt forfedre med høyt differensieringspotensial. Videre er den presenterte pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker UT AgResearch og Institutt for dyrevitenskap for å støtte og optimalisere denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av USDA grant.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
