माइकोबैक्टीरियम तपेदिक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से बाह्य पुटिका संवर्धन
Summary
यह प्रोटोकॉल आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, संस्कृति सतह पर तैरनेवालों से माइकोबैक्टीरियम तपेदिक बाह्य पुटिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक का वर्णन करता है।
Abstract
जीवाणु संक्रमण के संदर्भ में बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) की भूमिका माइक्रोबियल फिजियोलॉजी को समझने के लिए एक नए एवेन्यू के रूप में उभरी है। विशेष रूप से, माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) ईवीएस मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत और पर्यावरणीय तनाव की प्रतिक्रिया में भूमिका निभाते हैं। एमटीबी ईवी भी अत्यधिक एंटीजेनिक हैं और वैक्सीन घटकों के रूप में क्षमता दिखाते हैं। एमटीबी ईवीएस को शुद्ध करने का सबसे आम तरीका घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन है। इस प्रक्रिया में कई सीमाएं हैं, जिनमें कम थ्रूपुट, कम उपज, महंगे उपकरणों पर निर्भरता, तकनीकी चुनौतियां शामिल हैं, और यह परिणामी तैयारी को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) एक जेंटलर वैकल्पिक विधि है जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की कई सीमाओं का मुकाबला करती है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एसईसी एमटीबी ईवी संवर्धन के लिए प्रभावी है और तेजी से और स्केलेबल तरीके से बढ़ी हुई उपज की उच्च गुणवत्ता वाले एमटीबी ईवी तैयारी का उत्पादन करता है। इसके अतिरिक्त, परिमाणीकरण और योग्यता प्रक्रियाओं द्वारा घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना एसईसी के लाभों को दर्शाती है। जबकि ईवी मात्रा (नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण), फेनोटाइप (ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), और सामग्री (पश्चिमी सोख्ता) का मूल्यांकन एमटीबी ईवीएस के अनुरूप है, प्रदान किए गए वर्कफ़्लो को अन्य माइकोबैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
रोगजनकों द्वारा बाह्य पुटिका (ईवी) रिलीज संक्रामक रोगों को नियंत्रित करने के लिए नई प्रौद्योगिकियों को अनलॉक करने की कुंजी हो सकतीहै 1. माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) उच्च परिणाम का एक रोगज़नक़ है, जो दुनिया की लगभग एक तिहाई आबादी को संक्रमित करता है और हर साल लाखों लोगों के जीवन का दावा करताहै। एमटीबी द्वारा ईवी उत्पादन संक्रमण 3,4,5 के संदर्भ में इन ईवीएस के बायोजेनेसिस और विभिन्न भूमिकाओं (यानी, इम्यूनोस्टिमुलेटरी, इम्यूनोसप्रेसिव, लौह और पोषक तत्व अधिग्रहण) में अभी तक मायावी है। एमटीबी ईवीएस की संरचना को समझने के प्रयासों से प्लाज्मा झिल्ली से प्राप्त 50-150 एनएम लिपिड झिल्ली-संलग्न क्षेत्रों का पता चला जिसमें लिपिड और इम्यूनोलॉजिकल महत्व 3,6 के प्रोटीन होते हैं। जीवाणु शरीर विज्ञान में एमटीबी ईवी की भूमिका की जांच से अस्तित्व के लिए पर्यावरणीय तनाव के जवाब में बैक्टीरिया ईवी मॉड्यूलेशन के महत्व का पता चलाहै 5. मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन अध्ययन व्याख्या करने के लिए अधिक जटिल रहे हैं, लेकिन सबूत बताते हैं कि एमटीबी ईवीएस मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं और संभावित रूप से एक प्रभावी टीकाकरण घटक 3,4,7 के रूप में काम कर सकते हैं।
एमटीबी ईवीएस के अधिकांश अध्ययन इस प्रकार अब तक पुटिका संवर्धन8 के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन पर निर्भर हैं। यह छोटे पैमाने पर अध्ययन के लिए प्रभावी रहा है; हालाँकि, इस तकनीक में कई तकनीकी और तार्किक चुनौतियां हैं। वैकल्पिक वर्कफ़्लोजो मल्टीस्टेप सेंट्रीफ्यूजेशन, पूरे कोशिकाओं और बड़े मलबे को हटाने के लिए, गोली ईवीएस के लिए एक अंतिम अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण के साथ। यह पद्धति दक्षता में भिन्न हो सकती है, और अक्सर घुलनशील गैर-पुटिका से जुड़े बायोमोलेक्यूल्स की कम उपज और सह-शुद्धि के परिणामस्वरूप पुटिका अखंडता9 को भी प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, यह प्रक्रिया समय लेने वाली, मैन्युअल रूप से गहन है, और उपकरण की कमी के कारण थ्रूपुट में बहुत सीमित है।
वर्तमान प्रोटोकॉल घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के लिए एक वैकल्पिक तकनीक का वर्णन करता है: आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)। इस पद्धति को पर्यावरण माइकोबैक्टीरिया के लिए प्रदर्शित किया गया है, और वर्तमान कार्य में, इसे एमटीबी10 तक एक्सट्रपलेशन किया गया है। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम और स्वचालित अंश कलेक्टर पुटिका तैयारी में स्थिरता में सुधार कर सकता है और विशिष्ट, महंगे उपकरणों की आवश्यकता को कम कर सकता है। घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में समय के एक अंश में इस प्रोटोकॉल को पूरा करना भी संभव है, थ्रूपुट को बढ़ाना। यह तकनीक कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, जिससे मास्टर करना आसान हो जाता है, और अंतर / इंट्रा-प्रयोगशाला प्रजनन क्षमता बढ़ सकती है। अंत में, एसईसी में उच्च पृथक्करण दक्षता है और कोमल है, पुटिकाओं की अखंडता को संरक्षित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस बाह्य पुटिकाएं अत्यधिक एंटीजेनिक जलाशय हैं, जो उन्हें नैदानिक उपकरण और भविष्य के टीके 4,19,20 विकसित करने के लिए एक आकर्षक एवेन्यू के रूप में<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एनकेजी को कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन एंड बायोमेडिकल साइंसेज एक्सपीरिएंशियल अवार्ड और कॉलेज रिसर्च काउंसिल साझा अनुसंधान कार्यक्रम से समर्थन और केएमडी को एटीसीसी (पुरस्कार # 2016-0550-0002) द्वारा वित्त पोषण स्वीकार करना चाहते हैं। हम निम्नलिखित अभिकर्मकों के लिए तकनीकी सहायता और बीईआई संसाधन, एनआईएआईडी, एनआईएच के लिए ऐनी सिम्पसन को भी स्वीकार करना चाहते हैं: मोनोक्लोनल एंटी-माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस एलपीक्यूएच (जीन आरवी 3763), आईटी -54 (इन विट्रो में उत्पादित), एनआर -13792, मोनोक्लोनल एंटी-माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस ग्रोईएस (जीन आरवी 3418 सी), क्लोन आईटी -3
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
