Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño
Summary
Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.
Abstract
El papel de las vesículas extracelulares (EV) en el contexto de la infección bacteriana ha surgido como una nueva vía para comprender la fisiología microbiana. Específicamente, los EV de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempeñan un papel en la interacción huésped-patógeno y la respuesta al estrés ambiental. Los VEHÍCULOS eléctricos Mtb también son altamente antigénicos y muestran potencial como componentes de la vacuna. El método más común para purificar los EV Mtb es la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Este proceso tiene varias limitaciones, incluyendo bajo rendimiento, bajo rendimiento, dependencia de equipos costosos, desafíos técnicos, y puede afectar negativamente la preparación resultante. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es un método alternativo más suave que combate muchas de las limitaciones de la ultracentrifugación. Este protocolo demuestra que SEC es eficaz para el enriquecimiento de Mtb EV y produce preparaciones mtb EV de alta calidad de mayor rendimiento de una manera rápida y escalable. Además, una comparación con la ultracentrifugación del gradiente de densidad mediante procedimientos de cuantificación y calificación demuestra los beneficios de sec. Si bien la evaluación de la cantidad de EV (análisis de seguimiento de nanopartículas), el fenotipo (microscopía electrónica de transmisión) y el contenido (Western blotting) se adapta a los EV Mtb, el flujo de trabajo proporcionado se puede aplicar a otras micobacterias.
Introduction
La liberación de vesículas extracelulares (EV) por patógenos puede ser la clave para desbloquear nuevas tecnologías para controlar las enfermedades infecciosas1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno de alta consecuencia, infectando aproximadamente un tercio de la población mundial y cobrándose la vida de millones de personas cada año2. La producción de EV por Mtb está bien documentada pero es difícil de alcanzar en la biogénesis y las funciones variadas (es decir, inmunoestimulantes, inmunosupresoras, de hierro y adquisición de nutrientes) de estos EV en el contexto de la infección 3,4,5. Los esfuerzos para comprender la composición de los EV Mtb revelaron esferas encerradas en la membrana lipídica de 50-150 nm derivadas de la membrana plasmática que contienen lípidos y proteínas de importancia inmunológica 3,6. La investigación del papel de los EV Mtb en la fisiología bacteriana ha revelado la importancia de la modulación bacteriana ev en respuesta al estrés ambiental para la supervivencia5. Los estudios de interacción huésped-patógeno han sido más complicados de interpretar, pero la evidencia indica que los EV Mtb pueden influir en la respuesta inmune del huésped y pueden servir potencialmente como un componente de vacunación efectivo 3,4,7.
La mayoría de los estudios de EV Mtb hasta ahora se han basado en la ultracentrifugación por gradiente de densidad para el enriquecimiento de vesículas8. Esto ha sido eficaz para los estudios a pequeña escala; sin embargo, esta técnica tiene varios desafíos técnicos y logísticos. Los flujos de trabajo alternativos combinan la centrifugación de varios pasos, para la eliminación de células enteras y escombros grandes, con un paso final de ultracentrifugación para granular evs. Esta metodología puede variar en eficiencia y, a menudo, da como resultado un bajo rendimiento y copurificación de biomoléculas solubles asociadas a vesículas no vesículas, al tiempo que afecta la integridad de las vesículas9. Además, este proceso requiere mucho tiempo, es intensivo manualmente y tiene un rendimiento muy limitado debido a las limitaciones del equipo.
El presente protocolo describe una técnica alternativa a la ultracentrifugación por gradiente de densidad: la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Este método ha sido demostrado para micobacterias ambientales, y en el trabajo actual, se ha extrapolado a Mtb10. Una columna disponible comercialmente y un colector automático de fracción pueden mejorar la consistencia en la preparación vesical y reducir la necesidad de equipos específicos y costosos. También es posible completar este protocolo en una fracción del tiempo en comparación con la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que aumenta el rendimiento. Esta técnica es menos desafiante técnicamente, por lo que es más fácil de dominar, y puede aumentar la reproducibilidad inter / intra-laboratorio. Finalmente, SEC tiene una alta eficiencia de separación y es suave, preservando la integridad de las vesículas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis son reservorios altamente antigénicos, que las presentan como una vía atractiva para el desarrollo de herramientas diagnósticas y futuras vacunas 4,19,20. Históricamente, la ultracentrifugación por gradiente de densidad se ha utilizado para separar los EV Mtb de otros materiales solubles y secretados8. Si bien este proceso es efecti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer el apoyo de la Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencias Biomédicas Premio Experiencial y el Programa de Investigación Compartida del Consejo de Investigación Universitaria a NKG y la financiación de ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. También nos gustaría agradecer a Anne Simpson por su apoyo técnico y a BEI Resources, NIAID, NIH por los siguientes reactivos: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producido in vitro), NR-49223, y Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clon CS-35 (producido in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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