מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל
Summary
פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.
Abstract
תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בהקשר של זיהום חיידקי התגלה כאפיק חדש להבנת הפיזיולוגיה המיקרוביאלית. באופן ספציפי, כלי רכב חשמליים של Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ממלאים תפקיד באינטראקציה בין מארח לפתוגן ובתגובה ללחץ סביבתי. כלי רכב חשמליים מסוג Mtb הם גם אנטיגניים מאוד ומראים פוטנציאל כמרכיבי חיסון. השיטה הנפוצה ביותר לטיהור רכבים חשמליים מסוג Mtb היא אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות. לתהליך זה יש מספר מגבלות, כולל תפוקה נמוכה, תפוקה נמוכה, הסתמכות על ציוד יקר, אתגרים טכניים, והוא יכול להשפיע לרעה על ההכנה המתקבלת. כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC) היא שיטה חלופית עדינה יותר הנלחמת ברבות מהמגבלות של אולטרה-צנטריפוגציה. פרוטוקול זה מדגים כי SEC יעיל להעשרת Mtb EV ומייצר תכשירי Mtb EV באיכות גבוהה של תפוקה מוגברת באופן מהיר ומדרגי. בנוסף, השוואה ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות על ידי כימות והליכי הסמכה מדגימה את היתרונות של SEC. בעוד שההערכה של כמות EV (ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים), פנוטיפ (מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה) ותוכן (כתם מערבי) מותאמת לרכבים חשמליים מסוג Mtb, ניתן ליישם את זרימת העבודה המסופקת על מיקובקטריות אחרות.
Introduction
שחרור שלפוחית חוץ-תאית (EV) על ידי פתוגנים עשוי להיות המפתח לפתיחת טכנולוגיות חדשות לשליטה במחלות זיהומיות1. מיקובקטריום שחפת (Mtb) הוא פתוגן בעל השלכות גבוהות, מדביק כשליש מאוכלוסיית העולם וגובה את חייהם של מיליוני אנשים בכל שנה2. ייצור EV על ידי Mtb מתועד היטב ועם זאת חמקמק בביוגנזה ובתפקידים המגוונים (כלומר, אימונוסטימולטוריים, מדכאי חיסון, ברזל ורכישת חומרים מזינים) של כלי רכב חשמליים אלה בהקשר של זיהום 3,4,5. מאמצים להבין את הרכבם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb חשפו כדורים סגורים של 50-150 ננומטר של ממברנת השומנים הנגזרים מממברנת הפלזמה המכילים שומנים וחלבונים בעלי משמעות אימונולוגית 3,6. חקירת תפקידם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb בפיזיולוגיה של חיידקים גילתה את החשיבות של אפנון ר”ח חיידקי בתגובה ללחץ סביבתי להישרדות5. מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגנים היו מסובכים יותר לפענוח, אך הראיות מצביעות על כך שרכבים חשמליים מסוג Mtb יכולים להשפיע על התגובה החיסונית של המארח ועשויים לשמש כמרכיב חיסון יעיל 3,4,7.
רוב המחקרים על כלי רכב חשמליים מסוג Mtb עד כה הסתמכו על אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות להעשרת שלפוחית8. זה היה יעיל למחקרים בקנה מידה קטן; עם זאת, לטכניקה זו יש מספר אתגרים טכניים ולוגיסטיים. זרימות עבודה חלופיות מצמידות צנטריפוגה מרובת שלבים, להסרת תאים שלמים ופסולת גדולה, עם שלב אולטרה-צנטריפוגציה סופי לרכבים חשמליים כדוריים. מתודולוגיה זו יכולה להשתנות ביעילותה, ולעתים קרובות גורמת לתפוקה נמוכה ולטיהור משותף של ביו-מולקולות מסיסות שאינן קשורות לשלפוחית, תוך השפעה על שלמותהשלפוחית 9. בנוסף, תהליך זה גוזל זמן רב, אינטנסיבי באופן ידני ומוגבל מאוד בתפוקה בשל אילוצי ציוד.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה חלופית ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות: כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC). שיטה זו הוכחה עבור מיקובקטריה סביבתית, ובעבודה הנוכחית, היא עברה אקסטרפולציה ל- Mtb10. עמודה זמינה מסחרית ואספן שברים אוטומטי יכולים לשפר את העקביות בהכנת שלפוחית ולהפחית את הצורך בציוד ספציפי ויקר. ניתן גם להשלים פרוטוקול זה בשבריר מהזמן בהשוואה לאולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, מה שמגדיל את התפוקה. טכניקה זו פחות מאתגרת מבחינה טכנית, מה שמקל על השליטה בה, ויכולה להגביר את יכולת השכפול הבין-מעבדתית. לבסוף, ל-SEC יש יעילות הפרדה גבוהה והיא עדינה, תוך שמירה על שלמות הבועיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריום שחפת הן מאגרים אנטיגניים מאוד, המציגים אותן כאפיק אטרקטיבי לפיתוח כלי אבחון וחיסונים עתידיים 4,19,20. מבחינה היסטורית, אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות שימשה להפרדת כלי רכב חשמליים מסוג Mtb מחומרים מסיס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות על תמיכת המכללה לרפואה וטרינרית ומדעים ביו-רפואיים פרס חווייתי ותוכנית מחקר משותפת של מועצת המחקר של המכללה ל- NKG ומימון על ידי ATCC (פרס # 2016-0550-0002) ל- KMD. אנו רוצים גם להודות לאן סימפסון על תמיכה טכנית ומשאבי BEI, NIAID, NIH עבור הריאגנטים הבאים: שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LpqH (גן Rv3763), IT-54 (מיוצר במבחנה), NR-13792, שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום GroES (גן Rv3418c), שיבוט IT-3 (SA-12) (מיוצר במבחנה), NR-49223, ושחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LAM, שיבוט CS-35 (מיוצר במבחנה), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
