Elektroporation af plasmid-DNA i skeletmuskulatur er en levedygtig metode til at modulere genekspression uden at gå på kompromis med muskelkontraktilitet hos mus.
Transient genekspressionsmodulation i murine skeletmuskulatur ved plasmidelektroporation er et nyttigt værktøj til vurdering af normal og patologisk fysiologi. Overekspression eller knockdown af målgener gør det muligt for efterforskere at manipulere individuelle molekylære begivenheder og dermed bedre forstå de mekanismer, der påvirker muskelmasse, muskelmetabolisme og kontraktilitet. Derudover giver elektroporation af DNA-plasmider, der koder for fluorescerende tags, efterforskere mulighed for at måle ændringer i subcellulær lokalisering af proteiner i skeletmuskulatur in vivo. En vigtig funktionel vurdering af skeletmuskulatur omfatter måling af muskelkontraktilitet. I denne protokol viser vi, at undersøgelser af hele muskelkontraktilitet stadig er mulige efter plasmid-DNA-injektion, elektroporation og genekspressionsmodulation. Målet med denne instruktionsprocedure er at demonstrere den trinvise metode til DNA-plasmidelektroporation i museskeletmuskulatur for at lette optagelse og ekspression i myofibrene i tibialis forreste og extensor digitorum longus muskler samt at demonstrere, at skeletmuskelkontraktilitet ikke kompromitteres ved injektion og elektroporation.
Plasmid DNA-elektroporation i skeletmuskulatur in vivo er et vigtigt redskab til vurdering af ændringer i skeletmuskelfysiologi og molekylær signalering ved at modulere genekspression i en række fysiologiske og patofysiologiske tilstande 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Eksperimentel genoverførsel til skeletmuskulatur blev demonstreret allerede i 1990 af Wolff et al., hvor både RNA og DNA med succes blev overført uden elektroporation, og luciferaseekspression blev opretholdt i mindst 2 måneder10. Den relativt lave transfektionseffektivitet kun med injektion er problematisk, og Aihara og Miyazaki demonstrerede øget genoverførsel med elektroporation i 1998 ved at elektroporere en pCAGGS-IL-5-konstruktion i tibialis forreste (TA) muskel og måle serum IL-5-ekspression11. Siden da har mange undersøgelser undersøgt effekten af forskellige DNA-koncentrationer, volumener og elektroporationsparametre for at sikre maksimal genoverførselseffektivitet. Mir et al. testede forskellige elektroporationsparametre, herunder spænding, pulstal, pulsvarighed og frekvens samt DNA-koncentration og fastslog, at større spænding, pulstal og DNA-koncentration alle bidrog til øget elektroporationseffektivitet12. En stor advarsel mod høj elektroporationsspænding er, at mens det letter øget DNA-optagelse i myofibre, forårsager det også muskelskader, hvilket kan forvirre resultaterne. Schertzer et al. viste, at elektroporation ved 200 V forårsagede skade i omkring 50% af myofibrene 3 dage efter elektroporation, mens kun 10% af myofibrene blev beskadiget ved 50 V13. Vi har taget højde for de variabler, der påvirker effektiv DNA-overførsel versus muskelskade og fundet ud af, at en spænding på 125 V pr. Centimeter kaliberbredde er tilstrækkelig til at opnå effektiv genoverførsel.
Analyse af muskelfibertværsnitsareal og hel muskelkontraktilitet efter elektroporation er vigtige aspekter af metoden til måling af ændringer i muskelstørrelse og funktion på grund af genmodulation. Vi og andre har tidligere vist, at elektroporation af kontrolvektorer alene ikke forårsager et fald i myofiberområdet. Konstruktionen af det grønne fluorescerende protein (EGFP) var en nyttig fluorescerende indikator for DNA-transfektion i disse undersøgelser13,14. En række undersøgelser har undersøgt in situ kontraktilitet af TA efter elektroporation og fundet varierende resultater. En undersøgelse viste, at 75 V / cm elektroporation forårsagede ca. 30% reduktion i tetanisk kraft 3 dage efter elektroporation, og ved 7 dage efter elektroporation var tetanisk kraft tilbage til kontrolniveauet, mens 50 V / cm elektroporation ikke kompromitterede kraft13,15. En anden undersøgelse viste, at der var et tab på 30% af tetanisk kraft 3 timer efter 180 V / cm elektroporation, som kom sig til de falske kraftniveauer efter 7 dage16.
I den følgende detaljerede procedure demonstrerer vi injektion og elektroporation af et pcDNA3-EGFP plasmid i TA og extensor digitorum longus (EDL) muskler hos mus. Vi viser også, at denne metode ikke påvirker EDL helmuskelkontraktilitet. Målet er at demonstrere effektiv plasmidoptagelse i myofibre uden at forårsage tab af funktion.
In vivo-genoverførsel i skeletmuskulatur forstærket ved elektroporation er et nyttigt og relativt simpelt værktøj til modulering af proteinekspression i muskler. Vi har vist de trin, der kræves for at opnå effektiv genoverførsel i EDL- og TA-musklerne og demonstreret, at kontraktilitetsmåling af EDL er levedygtig efter proceduren. Denne teknik kræver ikke mere komplicerede virale vektorer og giver mulighed for sammenligning af transinficeret og ikke-transficeret muskelfiber tværsnitsareal i en enkelt m…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |