플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공
Summary
플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.
Abstract
플라스미드 전기천공에 의한 뮤린 골격근에서의 일시적 유전자 발현 조절은 정상 및 병리학적 생리학을 평가하는데 유용한 도구이다. 표적 유전자의 과발현 또는 녹다운을 통해 조사자는 개별 분자 사건을 조작할 수 있으며, 따라서 근육 질량, 근육 대사 및 수축성에 영향을 미치는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 또한, 형광 태그를 인코딩하는 DNA 플라스미드의 전기천공은 조사자가 생체 내에서 골격근에서 단백질의 세포내 국소화의 변화를 측정할 수 있게 한다. 골격근의 주요 기능 평가에는 근육 수축성의 측정이 포함됩니다. 이 프로토콜에서, 우리는 플라스미드 DNA 주입, 전기천공 및 유전자 발현 조절 후에도 전체 근육 수축성 연구가 여전히 가능하다는 것을 입증한다. 이 교육 절차의 목표는 경골 전방 및 신근 디지토럼 롱 근육의 근섬유에서 흡수 및 발현을 촉진하기 위해 마우스 골격근으로 DNA 플라스미드 전기 천공의 단계별 방법을 시연하고 골격근 수축성이 주입 및 전기 천공에 의해 손상되지 않는다는 것을 입증하는 것입니다.
Introduction
생체 내에서 골격근으로의 플라스미드 DNA 전기천공은 다양한 생리학적 및 병리생리학적 조건에서 유전자 발현을 조절함으로써 골격근 생리학 및 분자 신호전달의 변화를 평가하기 위한 중요한 도구이다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 골격근으로의 실험적 유전자 전달은 Wolff et al.에 의해 1990 년 초에 입증되었으며, RNA와 DNA는 모두 전기 천공없이 성공적으로 전달되었으며 루시퍼라제 발현은 적어도 2 개월 동안10 년 동안 유지되었습니다. 주사만으로 비교적 낮은 형질감염 효율은 문제가 있으며, 아이하라와 미야자키는 1998년 pCAGGS-IL-5 구축물을 경골 전방(TA) 근육으로 전기천공하고 혈청 IL-5 발현11을 측정함으로써 전기천공을 통한 유전자 전달 증가를 입증했다. 그 이후로 많은 연구가 최대의 유전자 전달 효율을 보장하기 위해 다양한 DNA 농도, 부피 및 전기 천공 매개 변수의 효능을 조사했습니다. Mir et al.은 DNA 농도뿐만 아니라 전압, 펄스 수, 펄스 지속 시간 및 주파수를 포함한 다양한 전기 천공 매개 변수를 테스트하고 더 큰 전압, 펄스 수 및 DNA 농도가 모두 전기 천공 효율 증가에 기여한다는 것을 확인했습니다12. 높은 전기 천공 전압에 대한 주요 경고는 근섬유로의 DNA 흡수 증가를 촉진하지만 근육 손상을 일으켜 결과를 혼란스럽게 할 수 있다는 것입니다. Schertzer et al. 200V에서의 전기 천공은 전기 천공 후 3 일 후에 근섬유의 약 50 %에서 손상을 일으킨 반면, 근섬유의 10 %만이 50V13에서 손상되었음을 보여주었습니다. 우리는 근육 손상에 비해 효율적인 DNA 전달에 영향을 미치는 변수를 고려했으며 캘리퍼 너비의 센티미터 당 125V의 전압이 효과적인 유전자 전달을 달성하기에 충분하다는 것을 발견했습니다.
전기천공 후 근육 섬유 단면적 및 전체 근육 수축성의 분석은 유전자 조절에 의한 근육 크기 및 기능의 변화를 측정하는 방법의 중요한 측면이다. 우리와 다른 사람들은 이전에 제어 벡터의 전기 천공만으로는 근섬유 영역의 감소를 일으키지 않는다는 것을 입증했습니다. 녹색 형광 단백질(EGFP) 구축물은 이들 연구13,14에서 DNA 형질감염의 유용한 형광 지표였다. 많은 연구가 전기 천공 후 TA의 계내 수축성을 조사하고 다양한 결과를 발견했습니다. 한 연구에 따르면 75V/cm 전기천공은 전기천공 후 3일 동안 파상력이 약 30% 감소했으며, 전기천공 후 7일까지 파타닉 파워가 대조군 수준으로 돌아간 반면, 50V/cm 전기천공은 힘13,15를 손상시키지 않았다. 또 다른 연구에 따르면 180V / cm 전기 천공 후 3 시간 후에 파타닉 힘이 30 % 손실되어 7 일16 일 후에 가짜 힘 수준으로 회복되었습니다.
다음의 상세한 절차에서, 우리는 마우스의 TA 및 신근 디지토럼 롱구스 (EDL) 근육에서 pcDNA3-EGFP 플라스미드의 주사 및 전기천공을 입증한다. 우리는 또한이 방법이 EDL 전체 근육 수축성에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증합니다. 목표는 기능 손실을 일으키지 않고 근섬유로의 효율적인 플라스미드 흡수를 입증하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전기천공에 의해 강화된 골격근에서의 생체내 유전자 전달은 근육에서 단백질 발현을 조절하기 위한 유용하고 비교적 간단한 도구이다. 우리는 EDL 및 TA 근육에서 효율적인 유전자 전달을 달성하는 데 필요한 단계를 보여 주었고 EDL의 수축성 측정이 절차에 따라 실행 가능하다는 것을 입증했습니다. 이 기술은 더 복잡한 바이러스 벡터를 필요로 하지 않으며, 단일 근육에서 형질감염된 근?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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