אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

Summary

אלקטרופורציה של דנ”א פלסמידי לתוך שרירי השלד היא שיטה בת קיימא לווסת ביטוי גנים מבלי להתפשר על התכווצות השרירים בעכברים.

Abstract

אפנון ביטוי גנים חולף בשריר השלד של מורין על ידי אלקטרופורציה של פלסמיד הוא כלי שימושי להערכת פיזיולוגיה נורמלית ופתולוגית. ביטוי יתר או הפלה של גני מטרה מאפשר לחוקרים לתמרן אירועים מולקולריים בודדים, ובכך להבין טוב יותר את המנגנונים המשפיעים על מסת השריר, על חילוף החומרים של השריר ועל התכווצותו. בנוסף, אלקטרופורציה של פלסמידי דנ”א המקודדים תגים פלואורסצנטיים מאפשרת לחוקרים למדוד שינויים בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים בשרירי השלד in vivo. הערכה תפקודית מרכזית של שרירי השלד כוללת מדידה של התכווצות השרירים. בפרוטוקול זה אנו מראים כי מחקרי התכווצות שרירים שלמים עדיין אפשריים לאחר הזרקת דנ”א פלסמידית, אלקטרופורציה ומודולציה של ביטוי גנים. מטרתו של הליך הדרכה זה היא להדגים את השיטה שלב אחר שלב של אלקטרופורציה של פלסמיד דנ”א לתוך שרירי השלד של העכבר כדי להקל על קליטה וביטוי במיופיבר של שרירי הטיביאליס הקדמיים והיציבים של שרירי ה- ditensor digitorum longus, כמו גם כדי להראות כי התכווצות שרירי השלד אינה נפגעת על ידי הזרקה ואלקטרופורציה.

Introduction

אלקטרופורציה של DNA פלסמיד לשרירי השלד in vivo היא כלי חשוב להערכת שינויים בפיזיולוגיה של שרירי השלד ובאיתות מולקולרי על ידי אפנון ביטוי גנים במגוון מצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . העברת גנים ניסיונית לשריר השלד הודגמה כבר בשנת 1990 על ידי Wolff et al., שם גם רנ”א וגם דנ”א הועברו בהצלחה ללא אלקטרופורציה, וביטוי לוציפראז נשמר במשך חודשיים לפחות¹⁰. יעילות הטרנספקציה הנמוכה יחסית עם הזרקה בלבד היא בעייתית, ואיהארה ומיאזאקי הדגימו העברת גנים מוגברת עם אלקטרופורציה בשנת 1998 על ידי אלקטרופורציה של מבנה pCAGGS-IL-5 לשריר הקדמי של טיביאליס (TA) ומדידת סרום IL-5 ביטוי¹¹. מאז, מחקרים רבים חקרו את היעילות של ריכוזי DNA שונים, נפחים ופרמטרים של אלקטרופורציה כדי להבטיח יעילות מקסימלית של העברת גנים. Mir et al. בחנו פרמטרים שונים של אלקטרופורציה, כולל מתח, מספר פולס, משך פולס ותדירות, כמו גם ריכוז DNA, וקבעו כי מתח גדול יותר, מספר פולס וריכוז DNA תרמו כולם ליעילות אלקטרופורציה מוגברת¹². אזהרה מרכזית למתח אלקטרופורציה גבוה היא שבעוד שהוא מאפשר קליטה מוגברת של דנ”א למיופיברים, הוא גם גורם לנזק לשרירים, מה שעלול לבלבל את התוצאות. Schertzer et al. הראו כי אלקטרופורציה ב-200 V גרמה לנזק בכ-50% מהמיופיברים 3 ימים לאחר האלקטרופורציה, בעוד שרק 10% מהמיופיברים ניזוקו ב-50 V¹³. לקחנו בחשבון את המשתנים המשפיעים על העברת דנ”א יעילה לעומת נזק לשרירים ומצאנו שמתח של 125 וולט לסנטימטר של רוחב קליפר מספיק כדי להשיג העברת גנים יעילה.

ניתוח של אזור חתך סיבי שריר והתכווצות שריר שלם לאחר אלקטרופורציה הם היבטים חשובים של השיטה למדידת שינויים בגודל השריר ובתפקוד עקב אפנון הגנים. אנו ואחרים הוכחנו בעבר כי אלקטרופורציה של וקטורים לבקרה לבדה אינה גורמת לירידה באזור המיופייבר. מבנה החלבון הפלואורסצנטי הירוק (EGFP) היה אינדיקטור פלואורסצנטי שימושי לטרנספקציה של דנ”א במחקרים אלה^13,14. מספר מחקרים בחנו את התכווצות ה-TA באתרה לאחר אלקטרופורציה ומצאו תוצאות שונות. מחקר אחד הראה כי אלקטרופורציה של 75 V/cm גרמה לירידה של כ-30% בכוח הטטאני 3 ימים לאחר האלקטרופורציה, וב-7 ימים לאחר האלקטרופורציה, הכוח הטטאני חזר לרמת הבקרה, בעוד אלקטרופורציה של 50 V/cm לא פגעה בכוח^13,15. מחקר אחר הראה כי היה אובדן של 30% של כוח טטאני 3 שעות לאחר אלקטרופורציה של 180 V/cm, אשר התאושש לרמות כוח הבושה לאחר 7 ימים¹⁶.

בהליך המפורט הבא, אנו מדגימים הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמיד pcDNA3-EGFP בשרירי TA ו- extensor digitorum longus (EDL) של עכברים. אנו גם מראים כי שיטה זו אינה משפיעה על התכווצות השרירים השלמים של EDL. המטרה היא להדגים ספיגת פלסמיד יעילה במיופיברים מבלי לגרום לאובדן תפקוד.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בבית הספר לרפואה של פן סטייט, שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פן סטייט, ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ובתיקוניה המאוחרים יותר. נקבת עכברי C57BL/6 בת 12 שבועות שימשה להליך זה. כל הכלים הכירורגיים עבר?…

Representative Results

אלקטרופורציה כדי להקל על העברת גנים בשרירי השלד היא טכניקה שימושית המשמשת להערכת שינויים בפיזיולוגיה של השריר. הדגמנו הליך מפורט, שלב אחר שלב, להשגת העברת גנים יעילה הן בשרירי TA והן בשרירי EDL. הבדלים ביעילות הטרנספקציה מתרחשים עקב מספר משתנים. בין המשתנים הללו ניתן למנות פרמטרים של אלקטרו?…

Discussion

העברת גנים In vivo בשרירי השלד המשופרת על ידי אלקטרופורציה היא כלי שימושי ופשוט יחסית לאפנות ביטוי חלבונים בשריר. הראינו את הצעדים הנדרשים להשגת העברת גנים יעילה בשרירי ה-EDL וה-TA והוכחנו שמדידת התכווצות של ה-EDL היא בת קיימא לאחר ההליך. טכניקה זו אינה דורשת וקטורים ויראליים מסובכים יותר ומ…

Materials

4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section