Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Summary

A causa dell’opacità del suolo, le interazioni tra i suoi microbi costituenti non possono essere facilmente visualizzate con risoluzione cellulare. Qui vengono presentati due strumenti microfluidici, che offrono nuove opportunità per studiare le interazioni fungo-microbiche. I dispositivi sono versatili e semplici da usare, consentendo un elevato controllo spaziotemporale e immagini ad alta risoluzione a livello cellulare.

Abstract

I funghi filamentosi sono abitanti di successo del suolo e svolgono un ruolo importante negli ecosistemi del suolo, come nella decomposizione della materia organica e inorganica, nonché nella regolazione dei livelli di nutrienti. Lì trovano anche numerose opportunità di interagire con una varietà di altri microbi come batteri o altri funghi. Studiare le interazioni fungine a livello cellulare, tuttavia, può essere difficile a causa della natura del suolo simile a una scatola nera. Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti microfluidici per lo studio delle interazioni fungine; sono evidenziate due piattaforme progettate per studiare le interazioni batterico-fungine e fungino-fungine. All’interno di questi microcanali, le interazioni fungo-microbiche possono essere monitorate in ambienti fisico-chimici controllati a una risoluzione temporale e spaziale più elevata di quanto fosse possibile in precedenza. L’applicazione di questi strumenti ha prodotto numerose nuove intuizioni biologiche, come l’osservazione dell’attaccamento polare batterico alle ife o la rivelazione di antagonismi fungino-fungini non caratterizzati. Una caratteristica fondamentale di queste metodologie riguarda la facilità d’uso di questo strumento da parte di non esperti, producendo tecnologie altamente traducibili per l’uso nei laboratori di microbiologia.

Introduction

Il suolo è un ambiente eccezionalmente diversificato contenente un’abbondanza di microrganismi che sono strumentali ai cicli del carbonio e del fosforo ^1,2. I funghi filamentosi sono una componente importante di numerosi ecosistemi come decompositori di materia organica e inorganica e possono migliorare la nutrizione delle piante attraverso la formazione di relazioni simbiotiche ^3,4. All’interno del suolo, i funghi interagiscono dinamicamente con una moltitudine di microbi come altri funghi⁵, batteri⁶, virus⁷ e nematodi⁸. Queste interazioni hanno conseguenze significative per la salute del suolo e delle piante. Tuttavia, a causa della mancanza di sistemi sperimentali appropriati in grado di eseguire l’imaging di microrganismi interagenti ad alta risoluzione, molti rimangono indefiniti.

Le indagini riguardanti le interazioni batterico-fungine (BFI) e le interazioni fungo-fungine (FFI) hanno preziose applicazioni in una vasta gamma di campi, tra cui gli antimicrobici in medicina e gli agenti di controllo biologico in agricoltura. Ad esempio, il fungo Coprinopsis cinerea produce il peptide copsina, che ha dimostrato di esibire attività antibatterica contro il patogeno umano Listeria monocytogenes⁹. Allo stesso modo, il composto di derivazione fungina, griseofulvina, è ampiamente usato come trattamento per le infezioni fungine umane ed è inoltre in grado di inibire la crescita del fungo patogeno della pianta Alternaria solani^10,11. Diversi ceppi del batterio Bacillus subtilis che abita nel suolo hanno anche dimostrato di essere efficaci agenti di biocontrollo del patogeno vegetale fungino Rhizoctonia solani^12,13. Tuttavia, a causa delle limitazioni associate alle metodologie tradizionali, i BFI e gli FFA sono poco compresi a livello di singole cellule.

Gli studi convenzionali in genere esplorano BFI e FFI su macroscala usando placche di agar con due o più specie in confronto. La loro interazione è valutata misurando i tassi di crescita e la produzione di metaboliti delle specie in confronto 14,15,16; tuttavia, questa metodologia è risolta solo a livello di colonia. Per studiare le interazioni a livello cellulare, gli inoculanti batterici e fungini possono essere coltivati su vetrini per microscopio rivestiti di agar che vengono poi ripresi al microscopio¹⁷. Tuttavia, può essere difficile seguire una singola ifa usando vetrini per microscopio a causa della mancanza di confinamento, il che significa che le immagini time-lapse sono più difficili da ottenere. Inoltre, l’opportunità di confinare spazialmente altri microrganismi all’interno di regioni definite del micelio fungino o di creare ambienti chimici definiti che possono essere perturbati, ad esempio, non è possibile in tali configurazioni. La natura “scatola nera” del suolo aggiunge anche alla complessità dello studio delle interazioni fungo-microbiche a livello di singole cellule¹⁸. Osservando le specie interagenti lontano dall’incredibile diversità del microbioma del suolo, è possibile valutare il modo esatto in cui i singoli membri interagiscono. Pertanto, vi è una continua necessità di piattaforme versatili che consentano l’imaging ad alta risoluzione a cella singola di BFI e FFA.

Le tecnologie microfluidiche, i cosiddetti sistemi lab-on-a-chip, forniscono una piattaforma ideale per lo studio di BFI e FONI a livello di singole celle. Il campo della microfluidica, originato da tecnologie sviluppate per l’analisi chimica e la microelettronica, è stato adottato dalle scienze biologiche¹⁹. Le tecnologie microfluidiche regolano piccoli volumi di fluidi all’interno di una rete su misura di canali miniaturizzati, aventi almeno una dimensione su scala micrometrica, e il loro uso nella ricerca biologica si sta espandendo^{di 20}. In particolare, sono stati sviluppati dispositivi microfluidici per esaminare la crescita di funghi filamentosi 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Uno dei vantaggi dell’utilizzo di questa tecnologia è che il confinamento delle ife e la distribuzione dei nutrienti all’interno di microcanali assomiglia più da vicino alla struttura dell’ambiente del suolo rispetto ai metodi convenzionali di agar³¹. Recentemente, le piattaforme microfluidiche sono state utilizzate per studiare le interazioni tra neutrofili umani e patogeni fungini³², batteri e radici vegetali³³, nonché funghi e nematodi^34,35.

Uno dei molti vantaggi dell’utilizzo della microfluidica per lo studio delle interazioni microbiche include il controllo specifico dell’ambiente dei microcanali. Ad esempio, i regimi di flusso laminare possono essere sfruttati per generare gradienti di concentrazione definiti, il che è particolarmente utile quando si esamina la chemiotassi batterica³⁶. Un altro vantaggio è che la natura trasparente del poli(dimetilsilossano) (PDMS), un polimero elastomerico economico e biocompatibile comunemente usato nella produzione di dispositivi microfluidici, facilita l’imaging ad alta risoluzione di singole cellule utilizzando la microscopia a campo luminoso e fluorescenza³⁷. Allo stesso modo, il confinamento dei microbi all’interno di microcanali significa che possono essere eseguiti esperimenti time-lapse che tracciano singole cellule, consentendo di registrare e quantificare le singole risposte cellulari³⁷. Infine, poiché i dispositivi microfluidici possono essere progettati per essere facili da usare, possono essere facilmente utilizzati da non esperti³⁸.

Approfondire la conoscenza delle interazioni tra microrganismi che vivono nel suolo è importante per migliorare le pratiche di gestione sostenibile degli ecosistemi che mantengono la biodiversità e per mitigare l’impatto dei cambiamenti climatici sugli ambienti terrestri³⁹. Pertanto, lo sviluppo di nuovi strumenti microfluidici è fondamentale per espandere la comprensione dei funghi e delle loro interazioni a livello cellulare. Il protocollo qui si concentrerà su due dispositivi microfluidici prodotti per lo studio di BFI⁴⁰ e FFI⁴¹ come rappresentato nella Figura 1.

Figura 1: Rappresentazione visiva e schematica dei dispositivi di interazione batterico-fungina (BFI) e di interazione fungo-fungino (FFI). (A) Immagine del dispositivo BFI. Una spina miceliale è posizionata all’ingresso di un’estremità dei microcanali per consentire la crescita ifale nel dispositivo. L’ingresso batterico si trova all’estremità opposta. Barra della scala = 5 mm. (B) Panoramica schematica del dispositivo BFI, raffigurante il posizionamento delle prese batteriche e la direzione della crescita ifale attraverso i microcanali di interazione. I canali sono profondi 10 μm, larghi 100 μm e lunghi 7 mm, con 28 canali di osservazione in totale. (C) Saggio di confronto su piastra di agar tra Coprinopsis cinerea e Bacillus subtilis NCIB 3610, barra di scala = 20 mm (sinistra). Immagini al microscopio che mostrano l’interazione tra C. cinerea e B. subtilis NCIB 3610 all’interno del microcanale (centrale e destro), cioè l’attaccamento polare dei batteri alle ife fungine. Barra della scala = 25 μm (al centro) e 10 μm (a destra). (D) Immagine del dispositivo FFI legato a una capsula di Petri con fondo di vetro, doppia inoculata con tappi miceliali. Barra della scala = 1 cm. (E) Panoramica schematica del dispositivo FFI. Due spine inoculanti fungine vengono introdotte nelle prese d’ingresso alle due estremità del dispositivo, consentendo l’esplorazione ifale dei microcanali. I canali di controllo sono collegati a un solo ingresso fungino e hanno un canale senza uscita, impedendo le interazioni tra i funghi di prova. I canali di interazione collegano entrambe le insenature fungine e consentono interazioni ifali tra i soggetti del test all’interno del microcanale. Ogni canale di interazione è costituito da 18 sezioni a forma di diamante, che misurano una lunghezza totale di 8,8 mm (490 x 430 μm per diamante), 10 μm di profondità e hanno una regione di collegamento tra ciascun diamante di 20 μm. I tipi di canale sono duplicati, barre di scala = 1 mm. (F) Zona di interazione tra due fronti ifali in avvicinamento, che crescono da estremità opposte del canale di interazione interconnesso. Immagine al microscopio a contrasto di fase, barra di scala = 250 μm. I pannelli in questa figura sono stati modificati da Stanley et al., 2014 (A-C)⁴⁰ e Gimeno et al., 2021 (D-F)⁴¹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Nota : un riepilogo delle procedure descritte in questo protocollo sono rappresentate visivamente nella Figura 2. Figura 2: Rappresentazione schematica della metodologia presentata composta da cinque sezioni principali dettagliate in questo protocollo. I progetti dei dispositivi vengono creat…

Representative Results

I risultati rappresentativi sono presentati dai dispositivi esemplari BFI40 e FFI41. Le misurazioni del tasso di crescita ifale possono essere facilmente ottenute utilizzando questi dispositivi in combinazione con tecniche di microscopia di base. La Figura 3A-B illustra le interazioni batterico-fungine tra C. cinerea hyphae e B. subtilis NCIB 3610. La presenza di B. subtilis arresta l…

Discussion

Questo articolo presenta un protocollo per lo studio delle interazioni fungo-microbiche utilizzando la microfluidica del canale. Gli autori mirano a dimostrare la versatilità di questi dispositivi e incoraggiare l’adattamento per soddisfare gli interessi del ricercatore. Utilizzando i dispositivi esemplari BFI e FFI, le interazioni fungine-microbiche possono essere studiate in modo più dettagliato di quanto precedentemente accessibile. Rimuovendo la complessità di fondo e l’eterogeneità del suolo, moderando la cresci…

Materials

Agar	Difco Laboratories	214010	Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoclave (VX-75)	Systec
Centrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlorotrimethysilane	Merck Life Sciences	386529	CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer	SLS	COR1000
Developer solution (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks	VWR	214-1108	e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji	ImageJ		Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air			Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers	SLS	INS5026
Forceps	Fisher Scientific Ltd	10008051	Bent, sharp
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1865	Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1866	Used in the development of master moulds
Glass media bottles	Fisher Scientific Ltd	15456113	e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM)	SAWATEC
Inoculation loop	VWR	COPA175CS01
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar flow hood	Air Science (PCR)		Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner	Suss Microtec
Malt extract	VWR	84618	Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer	Applied Materials	4700DP	Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount			3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water			Available as standard in biology labs.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon		Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S)	KOYO		Used for preparing silicon wafers
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparent film
Petri dishes, square sterile	Fisher Scientific Ltd	11708573	120.5 mm
Petri dishes, sterile	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithography mask	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Plastic cup	Semadeni	8323
Plastic spatula	Semadeni	3340
Portable precision balance (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter	Syneo	HS1251135P1183	Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter	Syneo	HS1871730P1183S	Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Razor blades	Häberle Labortechnik	9156110
Refridgerator	Haden		4-6 °C
Retiga R1 CCD camera	Qimaging		Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape	Office Depot	3969954	19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Silicon wafer	Inseto		100 mm
Soda lime glass plate	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist	MicroChem		CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.
Sylgard 184 elastomer kit	VWR	634165S	Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator	Okolab		Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope	Nikon	MEA54000	Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vacuum desiccator	Fisher Scientific Ltd	10528861	Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH20105	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH48230	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions