Determinación de la afinidad de unión (KD) de anticuerpos radiomarcados a antígenos inmovilizados

Summary

Aquí, se describe un método para determinar la afinidad de unión (K_D) de los anticuerpos radiomarcados a los antígenos inmovilizados. K_D es la constante de disociación de equilibrio que se puede determinar a partir de un experimento de unión a la saturación midiendo la unión total, específica e inespecífica de un anticuerpo radiomarcado a varias concentraciones de su antígeno.

Abstract

La determinación de la afinidad de unión (K_D) es un aspecto importante de la caracterización de los anticuerpos radiomarcados (rAb). Típicamente, la afinidad de unión está representada por la constante de disociación de equilibrio, K_D, y se puede calcular como la concentración de anticuerpos a la que la mitad de los sitios de unión de anticuerpos están ocupados en equilibrio. Este método se puede generalizar a cualquier anticuerpo radiomarcado u otros andamios de proteínas y péptidos. A diferencia de los métodos basados en células, la elección de antígenos inmovilizados es particularmente útil para validar las afinidades de unión después del almacenamiento a largo plazo de anticuerpos, distinguir las afinidades de unión de fragmentos de brazos de región de unión a antígenos (Fab) en construcciones de anticuerpos biespecíficos y determinar si hay variabilidad en la expresión de antígenos entre diferentes líneas celulares. Este método consiste en inmovilizar una cantidad fija de antígeno en pozos específicos en una placa rompible de 96 pocillos. Luego, se bloqueó la unión inespecífica en todos los pocillos con albúmina sérica bovina (BSA). Posteriormente, el rAb se agregó en un gradiente de concentración a todos los pozos. Se eligió un rango de concentraciones para permitir que el rAb alcance la saturación, es decir, una concentración de anticuerpos en la que todos los antígenos están unidos continuamente por el rAb. En pozos designados sin antígeno inmovilizado, se puede determinar la unión inespecífica del rAb. Al restar la unión inespecífica de la unión total en los pocillos con antígeno inmovilizado, se puede determinar la unión específica del rAb al antígeno. La K_D del rAb se calculó a partir de la curva de unión de saturación resultante. Como ejemplo, la afinidad de unión se determinó utilizando amivantamab radiomarcado, un anticuerpo biespecífico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las proteínas de transición mesenquimal-epitelial citoplasmática (cMET).

Introduction

Los anticuerpos radiomarcados (rAb) tienen una variedad de usos en medicina. Si bien la mayoría se utilizan en oncología como agentes terapéuticos y de imágenes, existen aplicaciones de imágenes para la inflamación relacionada con la reumatología, la cardiología y la neurología¹. Imaging rAbs tiene una alta sensibilidad para detectar lesiones y tiene el potencial de ayudar en la selección del paciente para el tratamiento 2,3,4,5. También se utilizan para la terapia debido a su especificidad para sus respectivos antígenos. En una estrategia conocida como teranóstica, se utiliza el mismo rAb tanto para la imagen como para el tratamiento⁶.

Idealmente, el anticuerpo elegido para el radiomarcado es uno que ya ha demostrado tener una alta afinidad y especificidad de unión utilizando métodos no radiomarcados. El radiomarcado de anticuerpos se puede lograr a través de la modificación química directa de anticuerpos con un radionúclido que forma enlaces covalentes estables (por ejemplo, yodo radioactivo), o indirectamente a través de la conjugación con quelantes que posteriormente se coordinan con radiometales ^7,8. El radiomarcado directo, como con yodo radioactivo, modifica específicamente los residuos de tirosina e histidina en el anticuerpo. Si estos residuos son importantes para la unión de antígenos, entonces esta radioconjugación alteraría la afinidad de unión. Por el contrario, existen múltiples protocolos establecidos para la conjugación y el radiomarcado indirecto de anticuerpos. Por ejemplo, un quelante común utilizado para unir zirconio-89 (⁸⁹Zr) para la obtención de imágenes PET de anticuerpos es el p-isotiocianatobencil-deferoxamina (DFO), que se conjuga aleatoriamente con residuos de lisina del anticuerpo ^9,10. Si hay residuos de lisina en la región de unión al antígeno, la conjugación en estos sitios podría dificultar estéricamente la unión al antígeno y, por lo tanto, comprometer la unión anticuerpo-antígeno. Así, los diferentes métodos de radioconjugación utilizados para el radiomarcado indirecto o directo de anticuerpos pueden afectar potencialmente a la inmunorreactividad, definida como la capacidad del anticuerpo radioconjugado para unirse a su antígeno ^7,11. Los métodos de conjugación específicos del sitio pueden eludir esta limitación, pero estas técnicas requieren ingeniería de anticuerpos para incorporar residuos adicionales de cisteína o experiencia en reacciones enzimáticas en residuos de carbohidratos 12,13,14,15,16. Una vez que un anticuerpo está radiomarcado, es importante probar si la inmunorreactividad se retiene como parte de la caracterización del rAb. Una forma de medir la inmunorreactividad es determinar la afinidad de unión del rAb.

El propósito de este protocolo es describir un proceso para determinar la afinidad de unión para rAbs utilizando un ensayo de saturación de radioligando establecido para cuantificar la unión a rAb-antígeno. La tendencia de enlace se describe en la Figura 1. La cantidad de antígeno unido aumentará a medida que se agregue más rAb a una cantidad fija de antígeno inmovilizado. Una vez que todos los sitios de unión a antígenos estén saturados, se alcanzará una meseta, y agregar más rAbs no tendrá ningún efecto sobre la cantidad de antígeno unido. En este modelo, la constante de disociación de equilibrio (K_D) es la concentración de anticuerpo que ocupa la mitad de los receptores de antígeno¹⁷. El K_D representa qué tan bien se une un anticuerpo a su objetivo con un K_D más bajo que corresponde a una afinidad de unión más alta. Anteriormente se informó que un rAb ideal debería tener un K_D de 1 nanomolar o menos¹⁸. Sin embargo, los rAbs más recientes se han desarrollado con K_D en el rango nanomolar bajo, y se consideran adecuados para aplicaciones de imágenes no invasivas 19,20,21,22. Otro parámetro que se puede determinar en el ensayo de saturación de radioligandos de rAbs es B_max, que corresponde a la cantidad máxima de unión a antígenos. B_max se puede utilizar para calcular el número de moléculas de antígeno si es necesario.

Figura 1: Curva de unión de saturación representativa. El porcentaje de antígeno unido se traza contra el aumento de las concentraciones de anticuerpos agregados a una cantidad fija de antígeno. Las ventanas emergentes muestran la vinculación en varios puntos. Se muestran la concentración y la unión correspondientes a K_D y B_máx., respectivamente. Esta figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este ensayo es particularmente importante para las construcciones de anticuerpos biespecíficos radiomarcados para determinar la K_D para cada fragmento de región de unión al antígeno (Fab) del brazo de anticuerpos biespecíficos radiomarcados con sus respectivos antígenos. Este protocolo se puede utilizar para determinar la K_D de cada brazo Fab por separado en antígenos inmovilizados para caracterizar de forma independiente si la afinidad de unión de cada brazo Fab por su respectivo antígeno se vio afectada después de la radioconjugación. Este protocolo se demuestra mediante el uso de amivantamab radiomarcado, un anticuerpo biespecífico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las proteínas de transición mesenquimal-epitelial citoplasmática (cMET)¹⁹. Los anticuerpos radiomarcados de un solo brazo, donde un brazo Fab se une a EGFR (α-EGFR) o a cMET (α-cMET) y el otro brazo Fab es un control de isotipo, también se utilizaron como ejemplos¹⁹. Este protocolo también es apropiado para cualquier anticuerpo radiomarcado con un antígeno conocido que pueda ser inmovilizado. En este protocolo, se agrega una serie de dilución del rAb a una cantidad fija de antígeno inmovilizado en pozos designados específicos para cada brazo Fab del rAb. El rAb también se agrega a los pocillos que solo han sido bloqueados con albúmina sérica bovina (BSA), sin antígeno, para determinar la unión inespecífica. Para determinar la unión específica, la unión inespecífica al antígeno inmovilizado se resta de la unión total de rAb. La curva de unión de saturación resultante se utiliza para determinar K_D, como se describió anteriormente.

Una ventaja de este método es una mayor reproducibilidad cuando se utilizan antígenos purificados en comparación con el uso de líneas celulares como fuente de antígenos, dado que los niveles de expresión de antígenos podrían verse afectados durante el cultivo celular y que las diferentes líneas celulares tienen niveles variables de expresión de antígenos. En el caso de los anticuerpos biespecíficos radiomarcados, las líneas celulares que solo expresan uno de los antígenos sin el otro pueden no estar disponibles, lo que haría que la caracterización de la afinidad de unión de los brazos Fab individuales sea muy difícil. En particular, la ventaja clave del método de ensayo de saturación de radioligando sobre los métodos no radiomarcados es la caracterización específica de la afinidad de unión del rAb sin la contribución de la fracción no conjugada del rAb. Según el mejor conocimiento de los autores, actualmente no existen técnicas de purificación para separar el rAb de su anticuerpo no conjugado padre. Dado el tamaño relativamente pequeño del quelante y el radionúclido, su contribución al peso molecular total del rAb es insignificante en cromatografía de exclusión de tamaño. Por lo tanto, el producto generado a partir de cualquier técnica de radiomarcado es casi siempre una mezcla del rAb y su anticuerpo no conjugado padre. La caracterización de la afinidad de unión mediante el ensayo de saturación radiomarcado garantiza que el producto que se está probando sea únicamente el rAb.

Protocol

NOTA: Consulte la Figura 2 para obtener una representación gráfica del protocolo. Figura 2: Esquema del protocolo. Las etiquetas de fila y columna se indican como una guía para configurar la placa rompible de 96 pocillos. La unión anticipada se muestra en un pozo de ejemplo para el antíg…

Representative Results

Este método calcula la afinidad de unión (KD) para un rAb basado en el ensayo de unión a la saturación donde se agregaron diferentes concentraciones de rAb a una cantidad fija de antígeno inmovilizado. La curva de unión debe seguir el crecimiento logarítmico donde inicialmente es empinado y luego se estanca a medida que el antígeno está saturado. Para garantizar que el KD determinado sea preciso, las concentraciones de rAb deben ser lo suficientemente altas como para alcanzar la saturación…

Discussion

Como parte del desarrollo de rAbs, es importante asegurarse de que un rAb se una específicamente a su objetivo con alta afinidad de unión. La determinación de la afinidad de unión puede informar si la inmunorreactividad del rAb se ve afectada por la radioconjugación a través del ensayo de saturación de radioligando utilizando antígeno inmovilizado. La determinación de la unión de rAb a BSA se puede utilizar para cuantificar la unión inespecífica para medir la unión específica al antígeno inmovilizado con m…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma Counter	Hidex	Hidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism Software	GraphPad		version 9.2; used for statistical analyses in this study
Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates	Thermo Scientific	473768
Microplate Sealing Tape	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Sodium Bicarbonate	JT Baker	3506-01
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949