RNA의 전사 후 변형은 최근에 중추 신경계 가소성과 관련이있는 번역 조절의 과소 연구 된 층을 나타냅니다. 여기에서, 샘플 준비 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법 접근법은 단일 뉴런에서 수많은 RNA 변형의 동시 특성화를 위해 기술된다.
RNA의 전사 후 변형 (PTMs)은 중추 신경계 (CNS)에서 번역의 조절에 관여하는 미연구 메커니즘을 나타낸다. 최근의 증거는 특정 뉴런 RNA 변형을 학습 및 기억 패러다임과 연결시켰다. 불행하게도, 이러한 에피전사체 특징의 검출을 위한 종래의 방법들은 단지 벌크 조직에서 고도로 풍부한 RNA 변형을 특성화할 수 있을 뿐이며, 활성화된 행동 회로 내의 개별 뉴런에 대해 존재할 수 있는 독특한 PTM 프로파일의 평가를 배제한다. 이 프로토콜에서는 단일 뉴런에서 수많은 변형된 리보뉴클레오시드를 동시에 검출하고 정량화하는 접근법(질량 분광법(SNRMA-MS)에 의한 단일 뉴런 RNA 변형 분석에 대해 설명합니다. 이 접근법은 해양 연체 동물의 개별 뉴런 인 Aplysia californica를 사용하여 검증되며, 뉴런 세포 몸체를 노출시키는 주요 CNS 신경절의 외과 적 분리 및 효소 치료로 시작하여 날카로운 바늘과 마이크로 피펫을 사용하여 수동 단일 뉴런 분리가 수행됩니다. 다음으로, 소량의 완충액에서 샘플의 기계적 및 열적 처리는 후속 RNA 소화를 위해 개별 세포로부터 RNA를 해방시키기 위해 수행된다. 이어서, 변형된 뉴클레오시드는 최적화된 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 사용하여 동정되고 정량화된다. SNRMA-MS는 형태학 및 기능을 알고 있는 A. californica 로부터 확인된 단일 뉴런에 대한 RNA 변형 패턴을 확립하는데 사용된다. 정성적 및 정량적 SNRMA-MS의 예가 뉴런 네트워크에서 개별 뉴런에 걸친 RNA 변형의 이질적 분포를 강조하는 것으로 제시된다.
RNA의 정준 뉴클레오시드에서의 변형은 단백질 번역의 조절에서 그들의 무수한 역할에 대해 점점 더 인식되고 있다. 현재까지 150개 이상의 독특한 RNA 변형이 메틸화, 헤테로원자 첨가, 세포 대사산물 1,2와의 접합에 이르기까지 복잡성의 범위가 보고되었다. epitranscriptome으로도 알려진이 확장 RNA 알파벳은 효소 작성자에 의해 생성되며 세포 RNA의 안정성3, 폴딩4 및 번역 효율 5,6을 변경하는 역할을합니다. 선택된 RNA 변형은 또한 효소적 지우개(7,8)를 통해 역전될 수 있는 반면, 다른 것들은 RNAs에 치환량론적으로9,10으로 부가되어, 생물학적 시스템에서 변형된 RNA 서열과 변형되지 않은 RNA 서열의 복잡한 풍경을 렌더링한다.
생물학적 기능에서 RNA 변형의 중요성은 중추 신경계 (CNS)의 하위 영역을 포함한 다른 기관 및 조직에 걸친 변형의 불평등 한 분포에 의해 나타납니다 11. 이러한 화학적 이질성은 CNS 개발(12), 스트레스 반응(13), 및 활성-의존적 가소성(14)과 연결되었다. CNS 서브영역은 개별 세포가 별개의 화학적 프로파일15,16,17,18을 나타내는 이종 세포 집단을 추가로 포함한다. 동일한 유형의 단일 세포조차도 조직 미세 환경(19) 및 확률적 유전자 발현(20)으로 인해 부분적으로 독특한 전사체를 표시할 수 있다. 그러나, 단일 세포 전사체의 특성화는 다소 일상적이지만, 다중 RNA 변형을 위한 단일 세포 에피텍토롬을 확립하기 위한 유사한 방법은 없다. 개별 세포에서 RNA 변형의 분포를 프로파일링할 수 있는 새로운 접근법은 CNS 및 다른 생물학적 시스템에서 전사 후 변형(PTM)의 세포 이질성 및 조절 영향에 대한 포괄적인 분석을 위해 필요하다.
벌크 세포/조직에서 수많은 RNA 변형의 동시 측정은 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법(LC-MS/MS) 기술을 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 변형된 리보뉴클레오시드의 LC-MS/MS 분석을 위해, RNA는 세포(전형적으로 10개의3-10 6개의 세포)로부터 추출되고, 침전 및 재현탁에 의해 정제되고, 이어서 뉴클레오시드로 소화된다. 정준 및 변형된 뉴클레오시드로 구성된 샘플 혼합물은 분석물 분리 및 검출을 위해 LC-MS 시스템에 주입된 후, 유기체21,22,23에서 RNA 변형의 완전한 보체의 결정으로 이어진다. LC-MS/MS는 최근 신경생물학적 모델인 Aplysia californica (A. californica)의 CNS에서 26개의 RNA 변형을 결정하는 데 사용되었습니다. 이들 후성전사학적 표식들 중 일부의 풍부함은 동물(24)의 행동 변화와 상관관계가 있는 시간-및 영역-의존적 역학을 나타내었다. 그러나, 상기 방법의 제한된 민감도로 인해 >103 세포를 함유하는 벌크 샘플에서만 RNA 변형을 검출할 수 있었다. 이 더 큰 샘플은 집단 평균을 가진 개별 세포의 독특하고 기능적으로 중요한 RNA 변형 프로파일을 숨길 가능성이 큽니다. 시료 준비 조건을 신중하게 조절하여 소량 샘플25,26,27,28에서 RNA 변형에 대한 검출 한계가 개선되었지만, 단일 세포에서 다중 변형된 리보뉴클레오시드를 검출하고 정량화할 수 있는 분석 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
이 프로토콜은 질량 분광법 (SNRMA-MS)에 의한 단일 뉴런 RNA 변형 분석을 도입하여 A. californica29의 CNS에서 단일 뉴런에서 수십 개 이상의 RNA 변형을 검출 할 수 있습니다. 이 접근법은 주요 CNS 신경절에서 확인 된 단일 세포를 외과 적으로 분리 한 다음 MS 호환 버퍼에서 기계적 세포 용해, RNA 변성 및 효소 가수분해와 관련된 최적화 된 샘플 준비 워크 플로우로 구성됩니다. 전사 후 변형된 뉴클레오시드의 확인 및 정량화는 LC-MS/MS. SNRMA-MS를 사용하여 수행됩니다. SNRMA-MS는 단일 뉴런에 대한 전사 후 RNA 변형 프로파일의 획득을 용이하게 함으로써 RNA 변형 분석 분야에서 충족되지 않은 요구를 충족시키며 향후 다른 세포 유형에 적용할 가능성이 있습니다.
SNRMA-MS는 최적화된 샘플 준비 접근 방식을 활용하여 LC-MS 플랫폼으로 전달할 수 있는 작은 MS 호환 샘플 볼륨을 제공합니다. CNS 신경절의 초기 효소 전처리는 격리 될 수있는 용이성과 격리 중 단일 뉴런의 내구성을 모두 지시합니다. 대뇌 신경절은 종종 협측, 흉막 및 복부 신경절에 비해 상대적으로 두꺼운 외피가 있기 때문에 연장 된 효소 치료가 필요합니다. 단일 뉴런 분리를 수행하는 개별 연구원은 미세 가위와 미세 포셉을 사용할 때 칼집이 얼마나 내구성이 있어야하는지에 대한 선호도가 다를 수 있습니다. 그러나 신경절이 과도하게 소화되지 않는 것이 중요한데, 이는 구조적 완전성의 상실, 표적 세포를 식별하는 데 중요한 위치 정보의 손실 및/또는 세포 용해로 이어질 수 있기 때문이다. 신경절로부터의 분리 후, 뉴런을 샘플 튜브로 옮길 때 최소한의 양의 분리 매질이 흡인되도록 하는 것이 중요하다. ASW 배지에는 RNA 가수분해 중에 소화 효소를 방해 할 수있는 고농도의 염이 포함되어 있으며 샘플을 희석합니다.
기계적 용해 단계 동안, 큰 뉴런 (>250 μm 직경)이 마이크로 피펫을 반복적으로 통과 할 때 파열되는 것이 일반적입니다. 더 작은 뉴런은 세포 용해를 보장하기 위해 추가적인주의가 필요할 수 있으며, 이는 일반적으로 세포의 유리 모세관을 누르는 것을 포함합니다. 이 예에서, 샘플 버퍼의 부분 부피가 모세관 힘 때문에 모세관 내로 인입될 수 있다. 이 부피는 샘플이 손실되지 않도록 유리 모세관 끝에 압력을 가하여 샘플 튜브 내로 다시 전달될 수 있습니다.
가장 좋은 결과는 RNA 소화를 위한 효소를 첨가하기 전에 가열 단계를 포함함으로써 얻어진다. 이는 95°C에서 가열하면 RNases35 의 활성을 방해하고 RNA 바이오폴리머로부터 방출되는 뉴클레오시드의 양을 감소시킬 수 있는 RNA 이차 구조를 변성시키기 때문일 가능성이 높다. 안정한 동위원소 표지된 메티오닌으로 스파이크된 샘플을 사용한 대조군 실험은 열-유도된 RNA 변형 아티팩트가 무열 SNRMA-MS 프로토콜29에 비해 RNA 변형에 대해 관찰된 증가된 피크 영역의 원인인지 여부를 조사하기 위해 이전에 수행되었다. 이러한 표지는 관찰되지 않았으며, 이는 최적화된 SNRMA-MS 방법을 사용한 RNA 변형에 대한 개선된 신호가 RNA의 우수한 소화 때문임을 나타낸다.
세포로부터 총 RNA를 분리하기 위한 종래의 방법은 페놀-클로로포름을 이용한 액체-액체 추출(LLE) 및 후속 RNA 침전, 세척 및 재현탁을 포함한다. 이러한 접근법은 선별된 유전자의 발현이 확인된 A. californica 뉴런36,37에서 용이하게 모니터링될 수 있는 역전사 중합효소 연쇄 반응 실험에 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, LLE 방법은 LC-MS에 의한 변형된 리보뉴클레오시드의 검출을 위해 충분한 RNA를 회수할 수 없는 반면, 본원에 기재된 SNRMA-MS 방법은 수많은 RNA 변형(29)의 검출을 가능하게 한다. 벌크 조직/세포 샘플에서 특정 RNA 유형(예를 들어, rRNA, tRNA, mRNA)의 변형 프로파일을 평가하기 위해, 음이온-교환 고체상 추출(24), 혼성화 프로브-기반 농축물(38), 및 크로마토그래피 분획화(39) 접근법이 적용되었지만, 단일 세포 RNA 정제를 위해 유사한 방법이 아직 이용가능하지 않다. 단일 세포로부터 특정 RNA 유형을 분리할 수 있는 RNA 분획화 접근법의 개발은 RNA 변형의 기능에 대한 추가적인 통찰력을 제공할 것이다.
SNRMA-MS는 A. californica 에서 단일 뉴런의 RNA 변형 풍경에서 이전에 특성화되지 않은 이질성을 밝혀 냈으며 포유류 세포에 걸쳐 유사하게 별개의 PTM 프로파일이 존재한다고 생각할 수 있습니다. 포유동물 세포는 이 프로토콜에서 분석된 큰 A. californica 뉴런에 비해 상대적으로 작기 때문에, 더 낮은 검출 한계를 용이하게 하기 위해 작은 샘플 부피의 취급에 있어서의 개선이 필요하다. 현재 SNRMA-MS는 ~5μL의 부피로 제한되어 있지만, 미세유체 액체 처리 장치를 워크플로우에 통합함으로써 상당한 개선이 이루어질 것으로 기대된다. 또한, 자동화 또는 반자동화된 세포 분리의 구현은 샘플 처리량을 증가시키고 더 큰 세포 집단의 단일 세포 RNA 변형 분석을 허용한다. 나노플로우 LC 분리(27)와 인터페이싱함으로써, 더 작은 세포에서도 에피전사체 마크의 특성화가 달성될 수 있을 것이다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 약물 남용 연구소 (National Institute on Drug Abuse)가 상을 수상했습니다. P30DA018310 및 국립 인간 게놈 연구소 상 번호 아래에. RM1HG010023. K.D.C.는 Beckman Institute 박사후 펠로우십의 지원을 인정합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 자금 조달 기관의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Animals | |||
Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
Benchtop equipment | |||
Glass capillary puller | Sutter | P-97 | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment |
Milli-Q water purification system | Millipore | Equipped with ESI source | |
Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
HPLC column and consumables | |||
Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
LC and MS Instrumentation and Software | |||
DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | ||
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | ||
RStudio | RStudio | ||
Microdissection tools | |||
Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
Reagents/Materials | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |